酵母单杂交实验步骤由普拉特泽生物总结分享。酵母单杂交(Yeast one-hybrid)是根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报告基因表达的原理，克隆与靶元件特异结合的转录因子基因(cDNA)的有效方法。普拉特泽生物——分子检测平台专业承接酵母单杂实验外包服务，总结了一套常用的酵母单杂实验步骤，一起来学习吧！

        一、构建诱饵菌株

        1、制备YM4271感受态细胞

        2、取上述感受态菌液，与1μg pHisi-cor promoter质粒混匀后加入预冷为0.2cm（electrode gap）电击转化杯（cuvette）中，置于冰上3min；

        3、设置BTX电转仪的参数进行电转化（高压脉冲1.8kV）5ms；

        4、吸出菌液后涂布至SD/ Ura-平板，正置1小时，然后28℃倒置培养2-5天，待其长出明显的单菌落。

        5、从平板上挑取单克隆落接种到2mL的液体SD/ Ura-中，30℃振荡培养过夜OD600达0.6-1.0。

        二、自激活验证

        1、以上步扩大培养的菌株，进行感受态细胞制备

        2、取该感受态菌液，与1μg pGADT7 AD质粒混匀后加入预冷为0.2cm（electrode gap）电击转化杯（cuvette）中，置于冰上3min；

        3、设置BTX电转仪的参数进行电转化（高压脉冲1.8kV）5ms；

        4、吸出菌液后涂布至SD/ Ura-Leu-平板，正置1小时，然后28℃倒置培养2-5天，待其长出明显的单菌落。

        5、从平板上挑取单克隆落接种到2mL的液体SD/ Ura-Leu-中，30℃振荡培养过夜OD600达0.6-1.0。

        6、配制含有不同浓度3-AT的SD/ Ura-Leu-平板，浓度设置为10，15，20，50ug/ml。

        7、按照五个稀释梯度，每滴2ul进行酵母点菌实验，28℃倒置培养3天，发现以上4个 3-AT浓度梯度下，均无菌落生长，选择5ug/ml 3-AT作为后续互作验证筛选浓度。

        三、转化诱饵菌株

        1、以步骤1中扩大培养的cor promoter诱饵菌株，进行感受态细胞制备

        2、取该感受态菌液，与1μg pGADT7-bHLH3质粒混匀后加入预冷为0.2cm（electrode gap）电击转化杯（cuvette）中，置于冰上3min；

        3、设置BTX电转仪的参数进行电转化（高压脉冲1.8kV）5ms；

        4、吸出菌液后涂布至SD/ Ura-Leu-平板，正置1小时，然后28℃倒置培养2-5天，待其长出明显的单菌落。

        5、从平板上挑取单克隆落接种到2mL的液体SD/ Ura-Leu-中，30℃振荡培养过夜OD600达0.6-1.0。

        相同方法转化cor promoter mutant诱饵菌株和jaz3 promoter诱饵菌株。

        四、阳性对照酵母YM4271/pGADT7-P53/SV40复苏

        1、取冻存的酵母YM4271/pGADT7-P53/SV40细胞，用接菌环在融化的菌液表面蘸一下，在SD/-Leu固体平板上划线，30℃倒置培养2天；

        2、从平板上挑取单克隆落接种到液体SD/-Leu中，30℃振荡培养过夜至OD600达0.8

        五、阴性对照酵母YM4271/pGADT7-lam/SV40复苏

        1、取冻存的酵母YM4271/pGADT7-lam/SV40细胞，用接菌环在融化的菌液表面蘸一下，在SD/-Leu固体平板上划线，30℃倒置培养2天；

        2、从平板上挑取单克隆落接种到液体SD/-Leu中，30℃振荡培养过夜至OD600达0.8

        六、点菌

        1、分别配制含有5ug/ml 3-AT的SD/-Leu/-his/-Trp平板和SD/-Leu/-Trp平板。

        2、将步骤3~5中扩大培养的菌株，按照五个稀释梯度，每滴2ul进行酵母点菌实验，28℃倒置培养7天，进行扫描观察。

        学会了吗？酵母单杂实验的详细操作步骤我们就全部介绍到这里啦，希望能给正在进行实验设计的你一些参考，如果您有酵母单杂实验外包的需求可以直接给客服留言，技术会马上给到回复~我们下期见！