酵母双杂实验常见问题及解决方法下篇由普拉特泽生物技术为大家总结分享。本文是关于酵母双杂实验的最后一篇介绍，前面我们学习了什么是酵母双杂、酵母双杂实验操作步骤、酵母双杂注意事项以及酵母双杂实操常见问题及处理的上篇，可以点击标题直接传送回去学习的哦。普拉特泽生物分子检测平台承接酵母双杂实验外包上百例，早就为大家把实验过程中要踩的雷、吃的亏帮大家吃完了，现在我们就来看看，实验过程中还有哪些常见的问题和解决方法吧！
  前期回顾：
  什么是酵母双杂？
  酵母双杂交实验详细操作步骤
  酵母双杂实验操作注意事项
  酵母双杂实验常见问题及处理（上）

        问题一：.酵母转化完成后可以用无菌水代替0.9%氯化钠溶液重悬菌体吗？

        可以的，生理盐水重悬的目的是为了维持渗透压，无菌水重悬酵母菌也可以，无菌水重悬后涂板和生理盐水重悬后涂板，转化效率并无明显差异。

        问题二：如何降低酵母双杂交系统中出现的假阳性？

        可以选择多个筛选标记进行更为严格的筛选，降低假阳性。

        问题三：诱饵蛋白是否一定需要自激活检测？

        不一定，自激活检测需要在Y2H Gold菌株中进行。主要作用有两个，其一，需要根据诱饵蛋白自激活的程度调整AbA的浓度或3-AT的浓度；其二，检测诱饵蛋白是否具有毒性，如果菌落生长过慢，可能表达的蛋白具有毒性，需要使用低拷贝的质粒表达诱饵蛋白。

        问题四：AbA浓度对酵母菌筛选有什么影响？

        AbA用于筛选阳性克隆，双杂常用浓度为100-200 ng/mL 。在阴性、阳性对照正常的前提下，如果筛选出来的阳性克隆数太少，可以将AbA浓度降至100ng/mL；如果筛选出来的阳性克隆数太多，排除自激活的前提下，相应增加AbA的浓度。AbA的有效浓度也与接种量有关，如因接种量过多在含AbA的平板长出连成片的菌落，使得AbA无法达到有效作用效果。

        问题五：3-AT的筛选浓度怎么选择，有没有建议的使用浓度范围？

        理想情况 10 mM浓度的3-AT平板会有少量生长，20 mM浓度的3-AT不能或极少生长。如果在80 mM浓度的3-AT平板上生长酵母，说明自激活活性太高，不能用于双杂交筛选。

        问题六：诱饵蛋白具有自激活活性，能够单独激活报告基因的表达怎么办？

        该蛋白如果是一个转录因子，具有转录激活域，需要去掉转录激活结构域。如果不是转录因子但仍具有较强的转录激活活性，需要将诱饵蛋白具有激活活性的区域去除，进行后续操作，但这样操作有可能影响蛋白间的互作。

        问题七：诱饵蛋白的大小是否对酵母双杂交的结果有影响？

        虽然文献报道从8-750个氨基酸都有成功的案例，但是分子量比较大的蛋白由于在酵母中可能存在折叠错误的情况，在实际工作中，分子量比较大的诱饵蛋白在酵母中寻找互作蛋白的成功率低于中等大小分子量的诱饵蛋白。

        问题八：酵母双杂交如何选择使用核体系还是膜体系文库？

        如果诱饵蛋白定位在膜上，使用膜体系文库；如果诱饵蛋白定位在细胞核则选择核体系；如果诱饵蛋白具有跨膜区，可以考虑把跨膜区去除或者选用定位在胞内的区域使用核体系进行筛库，但有一定风险。

        问题九：在酵母菌株中检测不到诱饵蛋白的表达或者表达不完全，怎么办？

        可能是酵母细胞的OD值太低，细胞数量少，导致诱饵蛋白量低，很难检测到，可以增加液体培养量；另一种原因可能是诱饵蛋白包含大量的稀有密码子，酵母很难进行翻译，建议优化氨基酸序列，合成一条由酵母细胞能够识别的密码子组成的编码相同的氨基酸序列的核苷酸，有望大大提高诱饵蛋白在酵母细胞中的表达。

        问题十：四缺板上筛选到的阳性克隆可以直接拿菌液或酵母质粒去测序吗？

        不行，因为酵母质粒拷贝数低，达不到测序浓度，所以需要将抽提出的质粒转到大肠杆菌培养后再测序。

        好啦，那关于酵母双杂实验的所有常见问题和解决方法我们就介绍完啦，如果您也对酵母双杂感兴趣准备做这个实验，可以参考咱们关于酵母双杂实验的介绍、步骤、注意事项与常见问题参考设计实验方案哦，还有不懂的可以直接给客服留言，我们会在第一时间给到您回复的哦！