大家好，今天普拉特泽生物跟大家一起学习的是酵母双杂实验的常见问题及解决方法上篇，酵母双杂交实验作为普拉特泽生物分子检测平台的常规实验，在上百例酵母双杂实验外包中，积累了大量的实操经验。酵母双杂交实验过程有时遇到非常多的问题，本文就把这些实验的常见问题解决方法分享给大家！

        问题一：灭菌后酵母培养基颜色变成棕褐色怎么办？

        SD系列的培养基预混了葡萄糖，在灭菌过程中由于灭菌时间较长，或者灭菌后在高温条件下长时间放置，引起培养基中葡萄糖碳化，导致颜色变深。通常情况下，对酵母培养不会产生较大影响（对个别毕赤酵母菌种影响较大），可以通过控制灭菌时间和灭菌温度来减少碳化程度，如118℃灭菌15分钟，并及时倒板。另外Coolaber产品中SC系列酵母培养基，不包含葡萄糖，需要将过滤除菌的葡萄糖加入灭菌后的酵母培养基中，这种方法配制的培养基，呈现透明偏白色。

        问题二： 酵母培养基不凝胶，或者凝胶硬度不够怎么办？

        调整酵母筛选培养基的pH（5.8）; 适当增加琼脂（建议量20g/L）。2019年后Coolaber公司出品的酵母培养基，只需要加入适量的去离子水，无需调pH，直接灭菌即可。

        问题三：培养过程中酵母细胞变成粉色的可能原因。

        培养基中腺嘌呤（Ade）浓度低；或酵母细胞代谢途径产生问题。一般通过往培养基中补加硫酸腺嘌呤（60mg/L）来改善这一情况。Coolaber所有酵母培养基均加入足够的腺嘌呤。实际操作中，酵母变粉色也并不影响蛋白间的相互作用。

        问题四：酵母细胞生长慢怎么办？

        可能原因：酵母表达的诱饵蛋白对细胞有毒害作用，影响酵母生长。

        解决办法：可通过选择低敏感性的酵母菌株；或选用低拷贝数的表达载体。

        问题五：诱饵蛋白对酵母细胞是有毒的，该怎样进行后续实验？

        在液体培养基中培养不好的菌株可以在固体培养基上生长得很好。首先重悬克隆于1mL的SD/–Trp（PM2251），接着将重悬液平铺于5 个100mm的SD/–Trp平板（PM2252），在30℃下温浴，直至平板上的克隆相互连在一起。用5mL 0.5X YPDA（PM2011）刮下每块板上的克隆，并收集到一管中，这样就可以使用这个细胞重悬液进行正常的杂交反应。

        问题六：筛选培养基上克隆太多怎么办？

        可能原因：可能诱饵蛋白存在自激活，自身就可以激活下游筛选标记的表达；或者是筛选条件过于宽松。

        解决办法：选用更为严格的筛选条件抑制诱饵蛋白的自激活活性，如果效果不理想，可以删除诱饵蛋白能够引起自激活活性的结构域，再用于酵母双杂交实验。

        问题七：筛选培养基上克隆太少怎么办？

        可能原因：酵母杂交效率低；或筛选条件太严格

        解决办法：延长杂交时间，提高杂交效率；放宽筛选条件。

        问题八：酵母质粒提取比较繁琐，有没有好的替代方法？

        Coolaber出品的酵母阳性克隆快速鉴定试剂盒（SK2420）仅仅需要高温加热酶解酵母菌3-5分钟就可以获取酵母质粒粗提物，完全可以用于PCR验证。

        问题九：获得的阳性克隆，PCR检测有多条片段。

        可能原因：一个酵母细胞可以包含多个捕获蛋白。

        解决办法：选取单克隆划板2-3次，进行蓝白斑筛选，直到没有分离，找到阳性克隆，用于后续实验。

        问题十：杂交效率不高，怎么办？

        效率不高，可能是杂交细胞数量不够，可以适当增加诱饵蛋白的液体培养量，保证有足够的细胞数量。也可以延长杂交时间，直至通过显微镜镜检观察到存在三叶草形状的合子产生，再进行后续操作。

        好啦，那关于酵母双杂交实验的常见问题上篇咱们就介绍到这里啦，如果没有您遇到过的问题可以看一看《酵母双杂实验常见问题下篇》，或者直接留言给客服，技术会一对一详细技术答疑的哦。如果您有酵母双杂实验外包的需求，请认准——普拉特泽生物！