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本期文章题目：

《HNRNPC impedes m6A-dependent anti-metastatic alternative splicing events in pancreatic ductal adenocarcinoma》于2021年在Cancer Letters杂志上发布，影响因子为9.756，那m6A和可变剪切会碰撞出什么不一样的火花呢，让我们拭目以待。

Fig 1 HNRNPC是转移性PDAC患者的一个潜在的预后因素

  数据库基因表达水平分析显示，HNRNPC在PDAC组织中显著过表达（均为P < 0.05，图1A-E）。此外，收集临床样本检测发现，HNRNPC在肝转移性PDAC组织中的表达显著高于非转移性PDAC组织（P < 0.01，图1F和G）。Kaplan-Meier曲线显示，HNRNPC高表达的PDAC患者的总生存期明显低于HNRNPC低表达的PDAC患者
（log-rankP<均为0.05，图1H和1I）。HNRNPC高表达患者的肝转移率明显高于HNRNPC低表达患者（log-rank P = 0.008，图1J）。这些结果突出了HNRNPC在PDAC中的潜在临床价值。

图1

Fig 2-3 HNRNPC增强体外PDAC细胞侵袭，促进体内PDAC肝转移

  为了研究HNRNPC在PDAC中的作用，在PANC-1和CFPAC-1细胞中敲除HNRNPC（图2A和2C），通过Transwell检测发现侵袭性降低（图2E和F）。相比之下，过表达HNRNPC（图2B和2D）促进了PDAC细胞的侵袭性（图2E和2F）。为了进一步确定HNRNPC在体内对PDAC的影响，将PDAC细胞（包括sh HNRNPC-PANC-1细胞及其对照细胞）原位注射到裸鼠胰腺中（图3A）。8周后，荧光成像显示原位胰腺肿瘤的强度无显著差异（图3B和3C）。但shHNRNPC组的转移灶强度明显低于对照组（图3D）。这些结果表明，HNRNPC增强PDAC细胞侵袭，促进PDAC肝转移。

图2

图3

Figure 4 HNRNPC调控了PDAC中TAF8的选择性剪接

  为了进一步阐明HNRNPC促进PDAC细胞侵袭性的机制，作者采用RNA测序的方法检测在PANC-1细胞中敲除HNRNPC后基因表达的变化。测序结果显示，HNRNPC影响了基因的选择性剪接数量，如TAF8、ACOX1和RNF121，这些基因在癌症发展中起着关键作用（图4A）。通过对选择性剪接显著改变的基因进行GO富集分析，作者发现在敲除HNRNPC后，转录因子IID（TFIID）和RNA聚合酶II组成的起始前复合物相关的基因显著富集（图4B）。

  通过在NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索转录本信息，作者发现由于TAF8S和TAF8L使用不同的终止密码子，因此TAF8S和TAF8L都可以被翻译（图4D）。剪接亚型TAF8L（包含第8外显子）的表达水平上调，而剪接亚型TAF8S（不包含第8外显子）的表达水平下调（图4C）。通过qRT-PCR（图4E和F）在PANC-1和CFPAC-1细胞中证实了这些结果。这表明TAF8的选择性剪切可被HNRNPC调控。

为了确定这两种亚型是否参与了HNRNPC介导的PDAC转移，作者首先在PANC-1和CFPAC-1细胞中敲除TAF8，然后分别表达TAF8S或TAF8L。Transwell检测显示，TAF8S促进了PDAC细胞的侵袭性，而TAF8L抑制了PDAC细胞的侵袭性（图4g和4H）。这些结果表明，HNRNPC影响了TAF8的选择性剪接，而TAF8L抑制PDAC细胞的侵袭性。

图4

Figure 5 HNRNPC以m6 A修饰依赖的方式调控TAF8的选择性剪接

  为了确定HNRNPC介导的TAF8选择性剪接的潜在机制，进一步研究HNRNPC是否与TAF8相互作用。作者通过使用网站预测TAF8的m6A结合位点（http://rmvar.renlab.org/）和RNA结合位点（http://rbpdb.ccbr.utoronto.ca/），发现在TAF8 pre-mRNA的第8外显子附近有5个潜在的m6A结合位点（图5A）和2个潜在的HNRNPC结合位点（图5B）。甲基化RNA免疫共沉淀（Me-RIP）检测显示，m6 A抗体与TAF8的结合强度高于IgG对照（P < 0.001，图 5A）。RNA免疫共沉淀（RIP）检测显示，HNRNPC与TAF8的结合明显高于IgG对照（P < 0.001，图5B）。

为了明确m6 A修饰是否增强了HNRNPC与TAF8的结合，作者对TAF8的m6 A结合位点进行突变，以及外源性TAF8-m6A突变实验（图5C）。在TAF8的m6A结合位点发生突变后，HNRNPC与TAF8之间的相互作用显著减弱（图5D）。在内源性突变TAF8的m6 A位点后，TAF8S亚型在PDAC细胞中的表达下降（图5E）。这些结果表明，TAF8的m6A位点突变可能会影响HNRNPC与TAF8转录本相互作用，导致TAF8L表达增加。

图5

Fig 6 TAF8L通过调节侵袭相关基因的表达来逆转HNRNPC在PDAC中的功能

  为了确定HNRNPC通过TAF8发挥作用，作者首先在PANC-1和CFPAC-1细胞中过表达HNRNPC然后过表达TAF8L（HNRNPC+/TAF8L+）。Transwell检测结果显示，与对照组相比，HNRNPC+/TAF8L +细胞的侵袭性明显降低（图6A和6B）。相比之下，在PANC-1和CFPAC-1细胞中敲除HNRNPC并敲除TAF8L（shHNRNPC+siTAF8L）。Transwell检测显示，与对照组相比，shHNRNPC + siTAF8L细胞的侵袭性显著增强（图6C和6D）。

  为了进一步探索TAF8发挥其生物学功能的途径，作者对sgTAF8-TAF8L + PDAC细胞进行了RNA测序。GSEA分析显示，侵袭性相关通路的表达发生了显著变化，如ERK通路（图6E和6F）。免疫印迹分析显示，敲除TAF8L可以逆转与肿瘤侵袭相关的HNRNPC靶基因的表达（图6G）。这些结果表明，TAF8L通过影响侵袭相关基因的表达来逆转HNRNPC在PDAC中的功能。

图6
文章主要阐述了HNRNPC在PDAC组织中过表达，其表达水平与PDAC患者的肝转移和总生存期较差相关。机制上，HNRNPC以m6A依赖的方式与TAF8转录本结合，导致TAF8的抗转移选择性剪接（TAF8L亚型）的下调，TAF8L逆转了HNRNPC在促进PDAC侵袭性方面的功能。

综上，今日“m6 A+可变剪切”解析就到此为止啦。

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