又是一年的国自然课题申报季，普拉特泽生物又来跟大家一起分享国自然基金申报的热门课题啦。今天依然是跟大家一起分享国自基金的热门医学课题——可变剪切，上期的热门课题文献分享也是可变剪切，区别在于这是一篇高分的优质文献，废话不多说，上文献：

        DDX17-regulated alternative splicing that produced an oncogenic isoform of PXN-AS1 to promote HCC metastasis.

        这篇是2021年在Hepatology期刊上发表（IF=17.298）的一篇文章。该文章主要对DDX17调控的选择性剪接，产生了PXN-AS1的致癌亚型，以促进HCC的转移的机制研究。

        Figure1DDX17是选择性剪接的重要调控因子，是与HCC转移密切相关的上调基因

        作者对肝外转移（EHMH）的原发性HCC组织和9对无转移HCC（MFH）组织进行了RNA测序，并对转录组数据中进行了分析。如图1A所示，在EHMH和MFH的可变剪接（AS）中，蛋白质编码基因显示出最多的可变剪接。进一步分析EHMH与MFH中的1070个差异AS，发现EHMH相对于MFH显著增加了差异剪接事件的发生（图1B）。通路富集分析显示排名最高的癌症转移相关通路对肌动蛋白细胞骨架、腺苷单磷酸激活蛋白激酶信号、NF-kB信号和粘附连接的调控效果显著（图1C）。与MFH相比，EHMH中共发现有140个存在差异表达的转移相关基因，其中70个存在显著可变剪切差异（图1D-E）。EHMH在转移相关基因上表现出更显著的可变剪切，其中A3SS、A5SS、IR和SE优先增加（图F）。这些数据表明，这些基因的剪接可能代表了肝癌转移的另一种机制。

        与MFH相比，EHMH中共有28个剪接调控因子的编码基因表达异常，其中27个基因表达上调，1个基因表达下调。在27个上调的基因中，根据其错误发现率（FDR）值，DDX17排名第一位（图1G）。对剪接调控因子与AS事件之间的相关网络分析显示，28个剪接调控因子调控了375个差异的ASE，它们参与了许多生物通路（图1H-I）。

        这些结果表明，DDX17在HCC转移中的起重要作用。

图1

        Figure2 高水平的DDX17与HCC患者的不良预后相关

        在TCGA-LIHC数据集中发现了HCC样本中DDX17高表达，这与患者的不良预后密切相关（图2A-B）。采用qPCR检测发现与邻近的非肿瘤肝组织相比，HCC中DDX17的mRNA水平显著升高（图2C-D）。HCC组织中DDX17的表达水平与HCC患者的总生存率呈负相关（图2E）。进一步通过qPCR和WB检测发现，与无转移的HCC组织相比，转移性HCC组织中DDX17的表达均有所升高（图2F-H）。

        这些结果表明，DDX17过表达与HCC的不良预后显著相关。

图2

        Figure 3 DDX17促进HCC的生长和转移

        通过荧光明胶降解和transwell侵袭、迁移实验发现，敲除DDX17显著抑制了MHCC97H和HCCLM3细胞的迁移和侵袭（图3A-B）。F-actin染色显示，在DDX17被敲除后，MHCC97H和HCCLM3细胞的片状足形成明显减少（图3C）。在DDX17 HKO小鼠中发现了肝肿瘤的数量和大小以及肺转移数目的显著减少（图3D-E）。此外，作者将稳定过表达DDX17的HCC细胞注射到原位肝左叶，建立小鼠肿瘤和肺转移模型。结果显示过表达DDX17显著促进了肝肿瘤的体积和数量，以及肺转移性结节和病灶的数量（图3F-G）。

        综上所述，体外和体内研究表明，DDX17在促进HCC生长和转移中发挥重要作用。

图3

        Figure 4 DDX17诱导肝癌细胞中lncRNA-PXN-AS1内含子3滞留。

        结合RIP-seq和RNA-seq数据，作者发现17个与DDX17相关的lncRNA，以及107个与DDX17相关的mRNA存在差异AS事件（图4A）。在lncRNA中最显著的AS事件中，作者注意到了选择性剪接事件的调控，包括40%的SE、26%的IR、17%的A5SS、14%的选择性3’剪接位点A3SS和3%的互斥外显子MXE（图4B）。在DDX17基因敲除细胞中，内含子3保留的转录本PXN-AS1-205基因（称为PXN-AS1-IR3）显著降低，而在过表达DDX17基因的细胞中，PXN-AS1-IR3基因显著上调（图4C-D）。在EHMH和MFH组织的RNA-seq中，存在第3内含子保留的PXN-AS1（图4E）。通过RIP实验发现DDX17与PXN-AS1存在有结合作用（图4F）。RNA pull down实验也进一步验证了PXN-AS1与DDX17的关联（图4G）。为了阐明DDX17介导PXN-AS1剪接的机制 ，构建了包含lncRNA-PXN-AS1第3外显子、第3内含子、第4外显子和侧翼内含子序列的PXN-AS1基因组，结果显示DDX17缺失抑制了内含子3的保留，而过表达DDX17则诱导了内含子3的保留（图4H-I）。此外，在DDX17敲除细胞中，PXN-AS1-IR3亚型的表达减少，而在DDX17过表达后，PXN-AS1-IR3表达增加（图4J）。

        综上所述，这些数据表明DDX17通过诱导HCC细胞中诱导内含子的保留来调控lncRNA-PXN-AS1的选择性剪接。

图4

        Figure 5 PXN-AS1-IR3可促进HCC细胞的体内外迁移

        在体外细胞实验中，过表达PXN-AS1-IR3，显著增加了体外伤口愈合能力、细胞迁移和侵袭能力（图5A-C）。荧光明胶降解实验显示，在异位表达PXN-AS1-IR3的HCC细胞中，细胞外基质降解活性增加，而PXN-AS1-WT组则没有显著变化（图5D）。在原位裸鼠HCC模型中，PXN-AS1-IR3过表达显著增强了肝癌变和肺转移，PXN-AS1-WT组对裸鼠的肝癌变和肺转移没有影响(图5E-F)。

        综上所述，这些结果表明PXN-AS1-IR3参与了DDX17介导的HCC迁移信号通路。

图5

        Figure6 PXN-AS1-IR3通过染色质修饰MYC增强子激活MYC信号通路

        作者进行了基因集合富集分析（GSEA），发现多个转移相关的生物过程，如MYC靶点、Wnt通路和notch信号通路等因PXN-AS1-IR3缺失显著下调（图6A）。通过GSEA分析发现，MYC信号通路的显著富集主要在PXN-AS1-IR3沉默的HCC细胞中（图6B）。QPCR结果显示，几个MYC靶点如PA2G4、CANX、PSMD7、NOP2、AIMP2、HSPE1、 LSM7、C1QBP、TRA2B、DUSP2、NOLC1、GRWD1、TFB2M和HSPD1，在PXN-AS1-IR3敲低后显著下调（图6C）。RIP实验发现PXN-AS1-IR3被MYC RIP富集，而PXN-AS1-WT没有被富集。RNA pulldown实验也证实了PXN-AS1-IR3和MYC蛋白之间的相互作用（图6D-E）。进一步用一系列截短的PXN-AS1-IR3片段进行RNA下拉分析，发现PXN-AS1-IR3的274-425-nt区域介导了与MYC的相互作用（图6F）。

        此外，PXN-AS1-IR3基因敲低导致MYC mRNA和蛋白水平下降（图6G），表明PXN-AS1-IR3可能在转录或转录后水平调控MYC的表达。接下来，在PXN-AS1-IR3敲低细胞或DDX17敲除细胞中过表达MYC，发现过表达MYC显著恢复了PXN-AS1-IR3敲低的HCC细胞的迁移和侵袭能力（图6H，I）。

        综上所述，这些结果表明MYC参与了DDX17-PXNAS1-IR3调控轴。

图6

        Figure7 PXN-AS1-IR3与Tex10相互作用调控MYC的表达促进HCC的进展

        运用RNA pull down和质谱分析，以鉴定与PXN-AS1-IR3相关的蛋白（图7A）。结果发现了睾丸表达蛋白10（Tex10），该蛋白通过修饰H3K4甲基化和招募共激活子组蛋白乙酰转移酶p300，在转录调控中发挥重要作用。RNA pull down实验和RIP实验证实了PXN-AS1-IR3与Tex10蛋白的显著结合，而与PXN-AS1-WT的结合很少（图7B-C）。Tex10基因沉默抑制了MYC蛋白水平（图7D）。过表达Tex10显著阻断了PXN-AS1-IR3敲低诱导的MYC蛋白抑制（图7E）。这些数据表明，尽管PXN-AS1-IR3增强了MYC蛋白的稳定性，但Tex10在PXN-AS1-IR3诱导的MYC表达中发挥主要作用。

        染色质免疫共沉淀分析进一步显示，PXN-AS1-IR3敲低显著降低了Tex10和p300在MYC基因增强子区域的结合，而PXN-AS1-IR3过表达则表现出相反的效果（图7F）。同样，PXNAS1-IR3基因敲低导致活性增强子标记物H3K4me1和H3K27ac表达水平下降（图7G）。因此，PXN-AS1-IR3敲低导致下游基因MMP2和MMP9启动子区MYC结合的富集减少，最终导致MMP2和MMP9的mRNA和蛋白水平降低（图7H-I）。

        这些数据表明，PXN-AS1-IR3通过与Tex10相互作用，通过表观遗传学调控MYC的表达，从而促进HCC的进展。

图7

        Figure8 人HCC中DDX17、PXN-AS1- IR3和MYC表达的相关性

        为了评估PXN-AS1在HCC患者中的临床意义，检测了84对原发性HCC和邻近非肿瘤肝组织中PXN-AS1-WT、PXNAS1-IR3和MYC mRNA水平，其中包括56对MFH和28对EHMH。与MFH相比，EHMH中PXN-AS1-IR3和MYC mRNA水平显著上调，而PXN-AS1-WT水平没有显著变化（图8A）。在EHMH组的血清和HCC组织中，PXNAS1-IR3水平显著升高（图8B-C）。相关分析显示，在40对EHMH中，DDX17与PXN-AS1-IR3、DDX17和MYC、PXN-AS1-IR3和MYC mRNA水平呈正相关（图8D-F）。

        综上所述，这些数据表明DDX17- PXN-AS1-IR3-MYC调控轴可能存在于体内。

图8

        文章主要阐述了：

        在低转移性HCC细胞中，PXN-AS1-WT是对MYC表达或HCC迁移无显着影响的主要亚型。在高转移性HCC细胞中，DDX17表达水平明显上调，导致PXN-AS1内含子3保留（PXN-AS1-IR3）。上调的PXN-AS1-IR3作为招聘Tex10和p300到MYC增强剂的支架。激活的MYC进一步增强包括MMP2和MMP9在内的下游基因的表达，最终促进HCC转移。

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