【跟着文献搞课题】之酸性肿瘤微环境研究思路

大家好！我又来和各位分享文献啦！每次和大家一起学习科研知识，都觉得是一件非常开心的事情！

这一期我们将会分享与肿瘤微环境相关的文献。在pubmed数据库中输入关键词“Tumor Microenvironment”，搜索结果是有49357篇文献，而且呈一个逐年升高的趋势，特别是近几年发的文章数量明显增多。

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然后查询“肿瘤微环境”相关的国自然的立项情况，近几年每年立项至少有40多项，2019年的立项个数超过了70项，再次佐证了肿瘤微环境相关的科研正在如火如荼的进行中。

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好啦，让咱们先来复习一下肿瘤微环境的概念吧！

肿瘤微环境（Tumor microenvironment ，TME）是由肿瘤细胞、常驻和招募的宿主细胞（与癌症相关的基质细胞和免疫细胞）、以及相应细胞的分泌产物（如细胞因子和趋化因子）和细胞外基质（ECM）中的非细胞成分组成，同时也可能存在TME的代谢产物和特定的环境。

肿瘤微环境是肿瘤细胞赖以生存和发展的非常复杂的环境，积极参与着肿瘤的发生、发展、转移等过程，与肿瘤细胞的生长密不可分，所以，积极的认识和探索肿瘤微环境，对未来攻克癌症可能会起到非常重要的作用。

今天分享的文献的题目是“The acidic tumor microenvironment drives a stem-like phenotype in melanoma cells”，影响因子为4.403，发表在《J Mol Med 》杂志上，主要研究了酸性的肿瘤微环境促进黑色素瘤细胞的干性特征，聚焦的是肿瘤微环境的“酸性”对肿瘤干性的影响。

这里给大家科普一下为什么说肿瘤微环境是酸性的？

了解肿瘤微环境的酸性，要从Warburg effect说起，通常来讲，正常细胞依靠线粒体氧化糖类分子释放出能量, 而肿瘤细胞则通过糖酵解作用产生能量的，甚至不需要氧气与线粒体参与；“肿瘤细胞的糖酵解率与正常组织比高200倍”，即使在氧气充足的条件下也会发生；而糖酵解过程产生了大量的乳酸，因为乳酸成酸性，从而使肿瘤细胞的微环境是呈酸性的。

好的，现在来正式讲解本篇文献了。本熊将从文献的7个实验结果循序渐进的分析作者是如何通过肿瘤微环境的“酸性”来探索其对肿瘤细胞干性作用的。

结果一：首先作者构建了两株“酸适应”黑色素瘤细胞（A375M6和M21细胞暴露在pH值为6.7的环境中约3个月，当它们的增殖速率与标准pH下的对照组细胞相似时，被认为是“酸适应”细胞，Fig 1a），因为EMT过程与干性有一定相关性，作者检测了EMT相关的蛋白的mRNA表达，发现两株酸适应细胞的EMT相关蛋白中的一部分蛋白有增高的趋势（Fig 1b），还发现CAIX（与耐药密切相关的肿瘤干细胞标志蛋白）和CD133（干性相关蛋白）在酸适应黑色素瘤细胞中共表达的比例明显比pH7.4的细胞高（Fig 1c，d），并且细胞干性的相关蛋白表达也明显增高（Fig 1c，d），这个结果说明“酸适应”细胞的干性比标准pH7.4培养的细胞可能更强。

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结果二：因为肿瘤细胞干性的自我更新能力较强，作者再通过黑色素瘤细胞成球实验来检测酸性微环境对肿瘤干性的作用。结果表明酸性微环境能明显促进肿瘤细胞成球能力（Fig 2a），再通过有限稀释法实验，检测到酸适应的肿瘤起始细胞（TIC）含量比标准pH条件下的明显增高（Fig2b），结果二说明增强细胞外的酸性，能增强黑色素瘤细胞的体外自我更新能力。

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结果三：由于肿瘤细胞干性的变化是一个动态的过程，具有很强的可塑性。于是，作者就想，如果细胞脱离酸性的环境，那它的干性会不会恢复到标准pH细胞的干性（干性相关蛋白表达和自我更新能力）呢？于是，作者把酸适应的两株黑色素瘤细胞放到pH7.4的条件下培养15天，15天后，检测肿瘤细胞干性相关蛋白的蛋白或mRNA表达变化、成球能力、肿瘤起始细胞含量的变化等情况，发现脱离酸性15天之后的细胞，或多或少的能减少干性的相关蛋白的蛋白或mRNA表达（Fig 3a，b），减弱细胞的成球能力（Fig 3c）以及减少肿瘤起始细胞的含量（Fig 3d），结果三说明，只要时间足够，酸性微环境对黑色素瘤细胞干性的促进作用可能能够得到逆转。

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结果四：有文献报道，EMT过程与细胞干性密切相关，而NF-κB通路又能调控EMT过程。因此，作者通过沉默RelA（可阻断NF-κB通路从而抑制EMT过程）来探讨EMT与干性的关系，结果发现，沉默RelA能减少细胞EMT和干性相关蛋白的部分蛋白或mRNA表达（Fig 4a，b），减弱细胞的成球能力（Fig 4c）以及减少肿瘤起始细胞的含量（Fig 4d），结果四说明，EMT是黑色素瘤细胞获得酸性环境诱导的细胞干性表型所必需的。

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结果五：前面结果已表明，酸性肿瘤微环境能促进黑色素瘤细胞的EMT过程及细胞干性，而且其干性的促进作用与EMT过程息息相关。作者进一步通过在体实验来进行验证。注射酸适应黑色素瘤细胞（A375M6注射10²和M21注射10³）进入小鼠体内后，与对照组相比，发现结节发生的时间更早、数量更多，肿瘤体积更大，肿瘤起始细胞的含量更多（Fig 5a，b）。

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结果六：结果一至结果五通过体外和体内实验均证实了酸性微环境能促进肿瘤细胞干性表型，出于科研思维的严谨性，作者在结果六采用了另一种方法又一次验证了酸性微环境对肿瘤细胞干性的作用，即通过特定分化刺激来检测分化成其他类型细胞的能力。作者采用了两种特定的分化方式：成脂分化和成骨分化，在特定条件下培养3周后，通过流式细胞仪检测间充质干细胞标记物（CD105、CD73、CD90）和造血干细胞标记物（CD34）的表达，发现酸性微环境可增加部分标志物的表达（Fig 6a）；通过RT-qPCR和油红O染色实验发现，成脂分化的部分标志蛋白的mRNA表达增高，脂滴增多（Fig 6b）；通过RT-qPCR和茜素红实验发现，成骨分化的部分标志蛋白的mRNA表达增高，磷酸钙沉积增多（Fig 6c）。结果六表明酸性微环境能增强黑色素瘤细胞的分化能力。

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结果七：既然酸性微环境可以促进黑色素瘤细胞的干性表型，那对其他的肿瘤细胞类型是否也有这样的影响呢？作者在前列腺癌细胞和结直肠癌细胞上发现，酸性微环境也促进了细胞干性的部分标志蛋白表达，增加了肿瘤起始细胞的含量，增强了前列腺癌细胞和结直肠癌细胞的成球能力。结果七提示酸性微环境促进细胞干性表型在不同肿瘤中可能一种普遍的现象。

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此篇文章主要研究了酸性肿瘤微环境对黑色素瘤细胞干性的作用，通过对肿瘤细胞的EMT标志蛋白、干性标志蛋白、自我更新能力以及分化成其它类型细胞的能力等多个方面，从体外及体内两个方面均证实了酸性微环境能够促进黑色素瘤细胞的干性表型，并在前列腺癌细胞和结直肠癌细胞上也得到了验证。整篇文献的讲解在这里就结束了，大家懂了啵？

其实这篇影响因子4分多的文章，思路是比较简单的，作者结合了当下的两个大热点——肿瘤微环境和肿瘤干性，通过几个经典实验方法（如肿瘤细胞成球、有限稀释法、成脂分化、成骨分化等），探寻了一下两者之间的关系，一篇影响因子为4.7460的文章就诞生啦！读完这篇文献，是不是觉得科研其实并没有那么难？各位亲爱的读者，一个行动胜过百个空想，不如自己去试试吧！