【神刊文献解读】生物医学神刊“NATURE”的文献解读

春已尽，夏初临，风与晨辉，这次我们的文献学习来点和之前不一样的，解读一篇今年3月刚刚在nature上线的文章~

相信小伙伴们对nature杂志应该很熟悉，是世界上历史悠久的、最有名望的科学杂志之一，首版于1869年11月4日发布。2022年更新的影响因子高达69.504。在许多科学研究领域中，很多最重要、最前沿的研究结果都是以短讯的形式发表在nature上。当之无愧的神刊！！

本次分享的文献题目是RBFOX2 modulates a metastatic signature of alternative splicing in pancreatic cancer，2023年3月发表在nature上线。

看题目是不是很简单，跟我们平时做的基础研究差不多，那它为啥能被nature收录呢，先来看看文章的思路：

直奔主体：分析胰腺导管癌（PDA）的选择性剪切，找到关键研究因子RBFOX2

文章以时下流行的测序和生信分析开头，聚焦于原发组和转移性组之间的差异性可变剪接事件（Fig 1a-1b）。对显著差异剪接事件的反应组通路富集分析显示，参与细胞骨架的组织和迁移的RHO GTPase通路中的基因富集（Fig 1c）。进一步对RHO GTPase通路基因中的差异剪接事件进行分析，发现这些事件的5’剪接位点上游最丰富的基序与RBFOX2结合序列具有高度的同源性（Fig 1d）。这些结果表明，RBFOX2介导的剪接可能通过细胞骨架的改变来调节转移过程。

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接下来分析RBFOX2对胰腺癌是如何发挥作用的

这部分内容，就是基础研究绕不开的功能检测了，我们一起简单看看：

首先，临床样本检测RBFOX2的表达：与原发肿瘤样本相比，患者来源的异种移植物（PDX）中剪接因子RBFOX2的蛋白水平较低，而mRNA水平没有显著差异（Fig 1e-1g），RBFOX2在PDA的转移过程中具有抑制肿瘤的作用。

然后，细胞水平探讨RBFOX2的异常表达对细胞转移能力的影响。采用了比较熟悉的划痕实验和集落形成实验。发现RBFOX2的过表达显著降低细胞的转移潜能（Fig 2a-2c，2e-2f）。

最后以动物实验收尾，将转染RBFOX2 cDNA的带mcherry标记的 PDX细胞以及GFP标记的RBFOX2缺失的原代PDA细胞静脉注射到NOD-SCID小鼠中，分析RBFOX2对体内侵袭的影响。结果显示，与注射对照组相比，RBFOX2过表达组肺转移瘤的数量显著减少（Fig 2d），RBFOX2缺失组肺转移数量增加，肿瘤体积显著增加（Fig 2g）。

最最后面，作者进行了回复实验。先构建了RBFOX2缺失了RNA识别基序（RRM）的 cDNA，共转染X50转移性PDA细胞（表达RBFOX2 sgRNA）和BxPC3原代PDA细胞，实验证实RBFOX2的RRM对其在PDA进展中的肿瘤抑制活性至关重要（Fig 2j-2n）。

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继续探讨RBFOX2介导的功能和下游信号轴

为深入探索RBFOX2的功能，作者在PDX细胞X50和BxPC3细胞中分别过表达和敲除RBFOX2后再次进行了高通量测序。对选择性剪接变化的评估发现，X50细胞中有474个显著差异剪接事件，BxPC3细胞中有458/488个显著差异剪接事件。为了确定RBFOX2的选择性剪接是否影响PDA细胞的转移，作者锁定了114个依赖于RBFOX2的选择性剪接事件（Fig 3a），这些事件主要为外显子跳跃（45%，Fig 3b）。进一步对87个RBFOX2调控的基因分析，发现大部分在RHO GTPase（RHOA、CDC42和RAC1）通路中的富集（Fig 3c）。

再来通过补充数据看看RBFOX2的异常表达对细胞功能（病灶粘附）的影响。paxillin免疫荧光显示，敲降RBFOX2的BxPC3细胞周围的病灶粘附形成增加。相比之下，过表达RBFOX2的X50细胞显示出病灶黏附形成减少。这些结果证实了RBFOX2的剪接活性对细胞病灶粘附的形成有影响。

对RHO GTPase通路的调控作用，主要选择MBQ167和硫唑嘌呤两个通路阻断剂。MBQ167抑制RBFOX2敲降的BxPC3细胞的迁移率，而对体外存活率或增殖率没有影响（Fig 3d-3f）。在小鼠体内，无论是静脉注射GFP标记的RBFOX2敲降的BxPC3细胞或GFP标记的X50细胞，均可抑制肺转移（Fig 3g，3h），但是对皮下原发性肿瘤的生长没有影响。来看看另一种阻断剂的情况：使用硫唑嘌呤在转移性的X50细胞系上也得到了类似的结果。然而，硫唑嘌呤治疗抑制了原发肿瘤细胞系BxPC3的原发肿瘤生长。总的来说，硫唑嘌呤和MBQ167是转移性PDA潜在治疗干预的良好候选者，MBQ167缺失的BxPC3细胞对RAC1和RHO抑制剂或RAC1敲除的作用更为敏感。

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最后重点分析RBFOX2的可变剪切靶点

这部分作者详细研究了RBFOX2的可变剪切位点。先锁定了RBFOX2调控的剪接事件之一是MPRIP的剪接。据报道，MPRIP通过其RHO gtpase激活蛋白活性来抑制RHOA，其对RHOA-rock通路具有抑制调控作用。目前还没有关于MPRIP的剪接亚型及其在转移中的作用的报道。RBFOX2的过表达诱导了MPRIP的第23外显子的包含，而RBFOX2的敲除诱导了该外显子的跳跃（Fig4a，4b）。与原发肿瘤相比，转移性PDA样本中外显子跳跃的MPRIP亚型的数量更高（Fig4c）。临床数据显示，MPRIP-低组患者的生存结局较差（Fig4d）。这些结果支持了MPRIP剪接事件在PDA进展中的临床相关性。因此，作者预测被跳跃的MPRIP亚型可能与PDA进展中的致癌活性相关。

接下来，测试MPRIP剪接的调节是否会影响PDA肿瘤细胞系的转移潜能。为了诱导MPRIP第23外显子的跳跃，针对第23外显子的3’或5’剪接位点设计了CRISPR sgRNAs。结果显示这两种sgRNAs都触发了第23外显子的有效跳跃（Fig 4e）。划痕和克隆形成实验证实，与对照细胞相比，敲低MPRIP的BxPC3细胞在软琼脂中的迁移能力和集落形成增加，但是对增殖率没有影响（Fig 4f，4g）。体内研究发现，与对照组细胞相比，静脉注射敲低MPRIP BxPC3细胞的小鼠体内肺转移灶数量显著增加（Fig 4h）。

最后，作者设计了包含MPRIP的第23外显子的一种sgRNA，通过基于CRISPR的突变中断RBFOX2基序，增加了第23外显子的内含物（Fig 4i）。含有靶向RBFOX2基序的sgRNA（DS-24 MPRIP sgRNA）的X50转移细胞在软琼脂中表现出明显缓慢的迁移能力和集落形成的减少，同样对增殖率没有影响（Fig 4j，4k）。为了在体内检测MPRIP剪接调节的作用，将表达CRISPR对照或DS-24 MPRIP sgRNA的GFP标记的X50转移细胞静脉注射到小鼠中。转移性X50细胞中包含的MPRIP第23外显子的转移性X50细胞中抑制了体内的转移潜能（Fig 4l），且局灶粘附更少。

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至此，文章的主要研究内容就结束了，后续作者用了三个补充Fig介绍了MPRIP第23外显子跳跃亚型与RAF/MAP激酶级联蛋白的结合作用以及MYL6和CLSTN1的选择性剪接对原发性肿瘤胰腺细胞的转移潜能的影响，因篇幅原因就不做详细讲解了。

回过头再来看看文章，在机制轴上研究不深，RBFOX2通过可变剪切调控下游基因MPRIP的表达，靶向RHO GTPase通路，从而影响胰腺癌的转移和侵袭。那么重点来了，这么简单的思路是怎么发nature的？难度是通过堆积实验量来得到编辑青睐的？答案肯定是否定的。既然实验结果我们没法找到满意的答案，我们来细细品品文章的实验方法：关键元素RBFOX2和可变剪切均来自于时下比较流行的高通量测序，基因敲除用到了难度较大的CRISPR基因敲除技术，细胞迁移实验也用到了实时成像系统，成分分析采用了质谱分析，细胞成像都用到了PYMOL三维成像软件。结合实验结果，看官们是不是就理解了文章为啥能被神刊青睐了呢？

本月文献分享到这就结束了哦！感兴趣的小伙伴们赶紧戳个关注呦，也可以加微信联系我们（微信号18570028002），下个月我们继续有趣的文献及神刊文献解读~

好啦，那我们今天就讲到这里，六月不见不散~