【国自然研究热点文献】之有氧糖酵解，“高分设计参考”！

今天介绍一份“保守扎实”的高分糖酵解课题可以怎么设计。

这篇文献的题目是：

LncRNA LINRIS stabilizes IGF2BP2 and promotes the aerobic glycolysis in colorectal cancer

一篇规规矩矩的lncRNA调控靶基因，促进肿瘤有氧糖酵解的作用机制文章，发表在2019年的Molecular Cancer杂志上（IF=15.302）。

好，现在就跟着我，踏着之前文献解读里整理的“标准步骤”往下看吧~

第一步，从0到1，我们要找到一个值得研究的基因（lncRNA LINRIS）

① 奔着科研问题从临床中来的原则。首先搜集21例临床组织样本做了一套测序，得到了233个表达差异基因，挑了30个进行进一步表达验证，最后分析获得了一个在结直肠癌中高表达的“候选人”：LINRIS（Fig 1A+补充材料）

然后又利用临床组织（118例，大场面啊……及结直肠癌细胞系，进一步对LINRIS在结直肠癌里的表达，及其与病患生存期、预后的关系进行检测分析（Fig 1B, C, E +补充材料）
同时还在其余多种肿瘤中，继续对LINRIS的表达进行检测，充分证明LINRIS促癌作用的“普适性”（Fig 1D, F）

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② 然后在科研模型里（结直肠癌细胞系）中简单验证一下LINRIS对结直肠癌的调控作用。用shRNA敲降LINRIS可以观察到细胞增殖活力和克隆形成能力的减弱（Fig 1G-I）。
同时，进一步分析了LINRIS在细胞中的具体分布：主要是分布在胞质中，而非胞核中（Fig 1J-L）
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第二步，从1到60，找到LINRIS的核心机制（Fig 2-3）

上一步已经证明了LINRIS主要是分布在胞质中，所以课题组就把寻找机制的方向放在了LINRIS直接结合和调控靶点蛋白的方式上，而非ceRNA机制。

① 首先，做RNA pulldown 然后质谱分析所有与LINRIS发生结合的蛋白，得到了18个蛋白。进一步排除掉分布在胞核中的蛋白，最后锁定了一个“候选人”：IGF2BP2。但是这些结果都没有展示，藏在补充材料里。
② 然后花式RNA pulldown，先证明IGF2BP2可以与LINRIS结合（Fig 2A, B），再证明IGF2BP2是特异性的与LINRIS结合，而非构建的质粒上其他不相关的元件（Fig 2C, D），接着证明了IGF2BP2既不是与LINRIS的C端，也不是与N端结合（Fig 2E），而是结合在LINRIS序列的 450-640bp位置（但是这么关键的数据，又是在附录里）。
最后在Fig 1E中同样的11株结直肠癌细胞系中检测了IGF2BP2的蛋白含量，并发现其表达规律与LINRIS呈正相关（Fig 2F, G）。而沉默LINRIS，可以下调IGF2BP2的蛋白含量，上调它的泛素化水平（Fig 2H, I）。
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② 具体研究LINRIS调控IGF2BP2泛素化的机制。

首先反过来分析LINRIS与IGF2BP2如何结合。RIP结果显示LINRIS主要结合在IGF2BP2 1-157bp区域，该区域包含了两个RNA识别基序（Fig 3A, B）。
其次分析结合后如何调控IGF2BP2的泛素化。IGF2BP2上有两个泛素化位点（K77, K139）。课题组对两个位点进行突变，然后发现，只有当K139位点发生突变后，可以阻断sh-LINRIS对IGF2BP2蛋白泛素化（Fig 3C）以及与IGF2BP2的结合能力（Fig 3D）的调控作用。
泛素化发生后，一般就是直接引起蛋白的降解。所以最后再研究LINRIS调控IGF2BP2泛素化以后，是如何调控IGF2BP2降解的。先用CHX蛋白稳定性检测实验再次证明，sh-LINRIS可以降低IGF2BP2的蛋白稳定性（Fig 3E），即确实可以加速IGF2BP2的降解。又已知泛素化后蛋白降解主要有UPS 和 ALP两条途径。所以最后进行一一验证：加入UPS抑制剂MG132，sh-LINRIS对IGF2BP2蛋白含量的抑制作用没有改变（Fig 3F）；而自噬抑制剂却可以明显逆转sh-LINRIS对IGF2BP2蛋白含量的抑制作用（Fig 3H），相反，自噬激动剂则可以像sh-LINRIS一样，促进IGF2BP2的降解（Fig 3I, J）

并且还做了回复实验，自噬相关蛋白ATG5的沉默，可以显著逆转sh-LINRIS对IGF2BP2蛋白稳定性的抑制作用（结果在补充协议里）

至此，本课题的核心机制就找到了：LINRIS通过靶向结合，可以抑制IGF2BP2蛋白 K139位点的泛素化及后续的自噬溶酶体降解，提高IGF2BP2蛋白的稳定性。
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核心机制验证完，后面的内容就都是水到渠成了。

第三步，从60到80，往LINRIS-IGF2BP2下游深挖机制

这篇SCI的核心创新性就是在于“第二部分”：首次发现了LINRIS与IGF2BP2的结合，及其对IGF2BP2泛素化降解的调控机制。所以后面这几步机制研究的选择都保守了很多。

IGF2BP2下游，就挑了一个IGF2BP2的经典靶点c-Myc，然后因为课题组一直都关注的是代谢功能，所以又挑了几个既是c-Myc下游，又是有氧糖酵解的标志物的基因（GLUT-1, PKM2, LDHA）进行检测验证。

① Q-PCR/WB结果显示 sh-LINRIS可以抑制c-Myc及GLUT-1, PKM2, LDHA的表达，且在临床样本中c-Myc, GLUT-1, PKM2, LDHA的表达与LINRIS的表达均呈正相关（Fig 4A-C）。

糖酵解标志功能细胞外酸化率（Fig 4D, E）及糖酵解途径代谢产物示踪检测（Fig 4F）结果显示，sh-LINRIS 可以显著抑制结直肠癌细胞的糖酵解过程。
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② 回复实验 1：IGF2BP2过表达，可以逆转 sh-LINRIS对细胞增殖活力（BrdU检测，Fig 4G）及细胞糖酵解水平（ECAR检测，Fig 4H-I）的抑制作用。

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③ 回复实验 2：IGF2BP2 K139R突变处理，同样可以阻断和逆转sh-LINRIS对细胞增殖活力及细胞糖酵解水平的抑制作用。（嗯……如果你没有看到展示图，那它就是在补充材料里……）

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④ 体内验证（看着平平无奇，胜在造模方法比较“高大上”）：

首先造了结直肠癌原位瘤，利用活体成像显示sh-LINRIS可以抑制结直肠癌生长（Fig 5A）；

然后造模PDX移植瘤，结果同样显示sh-LINRIS可以抑制结直肠癌生长（瘤体观测，Fig 5B-D），并降低了瘤体内Ki-67（细胞增殖活力标志物），及IGF2BP2, c-Myc的表达水平（IHC染色及定量，Fig 5E, F）

LINRIS-IGF2BP2下游机制找到：LINRIS通过提高IGF2BP2蛋白的稳定性，促进了下游c-Myc调控的糖酵解途径，从而促进肿瘤生长。

做完前面三步，一段相对完整的机制就验证完整了。差不多达到80分的水平，数据整合整合，差不多够发表一篇5分左右文章了~
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第四步，从80到100。往LINRIS-IGF2BP2上游继续深挖机制。

和下游机制一样，上游选的也是比较保守的机制。

① 进行生信预测分析（JASPAR），找到LINRIS启动子区的可能结合转录因子GATA3（Fig 6A）。并对GATA3在结直肠癌中的表达进行数据库分析（Oncomine），可得：GATA3在CRC组织中低表达，且表达越低，生存率越差（Fig 6B, C, 与LINRIS规律相反）

202305091401001360 ② 进行细胞验证：首先验证GATA3沉默对LINRIS表达水平的影响（Q-PCR, Fig 6D），然后验证GATA3与LINRIS启动子区的靶向结合关系（CHIP，Fig 6E）。最后证明，GATA3的靶向结合对LINRIS启动子活性的影响（荧光素酶启动子活性检测，Fig 6F-H）。

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③ 最后临床水平进行验证：Q-PCR（Fig 6I）和IHC（Fig 6J, K）实验证明，临床CRC样本中，GATA3与LINRIS的关系，与①/②部分通过数据库分析和细胞水平验证的结论一致。

LINRIS-IGF2BP2上游机制找到：GATA3可以结合并抑制LINRIS启动子活性，从而通过抑制LINRIS的表达发挥抑制肿瘤生长的作用。

设计到这个“第四步”，又多出来了一段机制。但是做到这个水平，和只做完前三步的水平差别不会特别明显，可能都会是在5-8分左右。

要想飞升到10分以上，还得往下看~

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最后一步，从100到120，“升华”。临床水平分析

本熊阔以负责任的嗦，么有哪个10分+ 的SCI最后一个figure 不喜欢玩“临床组织样本分析”这个套路的。

① 把CRC临床组织分为LINRIS高表达和 LINRIS低表达两类，IHC检测下游通路蛋白的表达情况。结果与前面实验结论一致。下游IGF2BP2/c-Myc/GLUT1/PKM2/LDHA的蛋白表达水平与LINRIS呈正比（Fig 7A, B）。

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② 再对临床组织中IGF2BP2的表达进行分析。IHC结果显示，IGF2BP2在CRC肿瘤组织中高表达（Fig 7C, D），且与病患的生存率呈负相关（Fig 7E）。

最后进一步把临床CRC病患分为“LINRIS/IGF2BP2均低表达”、“LINRIS/IGF2BP2中等表达水平”、“LINRIS/IGF2BP2均高表达”三类，再做生存率分析，可得：“LINRIS/IGF2BP2均高表达”生存率最差（Fig 7F）。

202305091403354162 综上我们的课题就做（du）完了，最后再华丽丽滴画个假说示例图

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这篇文章的设计内容读下来就是两个字：扎实！可以说是比较经典，规规矩矩的高分课题设计形式了。而且完成不同的步骤内容，大概对应的分值丰度，也给大家简单标注了一下。如果现在正好要设计相关方向课题的同学们，可以参考一下哟~

好啦，那我们今天就讲到这里

下次见咯！

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