今天是一篇发表于JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE（IF：17.579）的文章：骨髓来源的miR-223通过抑制NLRP3炎症小体调节肠道炎症虽然是一篇研究miRNA的文章，但是文章从免疫反应的调节回路入手，通过纳米治疗的方式证明科学论点。
炎症性肠病(IBDs)，即克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)。它们的病因尚不明确，因为它们涉及基因、环境和免疫调节因子之间复杂的相互作用。UC局限于结肠，是一种持续的浅表性疾病，主要累及结肠黏膜。CD可累及胃肠道的任何一段，三分之二的患者表现为免疫活跃的末端回肠疾病。对于UC和CD，目前的假说都认为肠道黏膜损伤是由微生物抗原引发的先天性免疫反应失调所致。因此，了解肠道中控制异常先天免疫反应的调节回路对我们理解炎症性肠病的发病机制至关重要。目前，miRNAs在黏膜免疫和IBD发病机制中的作用仍未被充分研究。然而，最近的研究表明，不同的miRNAs可以在维持免疫稳态中起着至关重要的作用。miR-223首先在造血系统中被识别和表征，并被证明在髓系室中特异表达。它在髓细胞分化过程中诱导，并受多种转录因子调控。此外，miR-223通过调控颗粒酶B、泛素连接酶Roquin、E2F1、nod样受体激活和NF-κB通路等多种基因转录，对髓细胞活性进行关键的精细调控，并在炎症性疾病中发挥多种作用。但在炎症性肠病中，miR-223在肠道NLRP3调节中的作用尚不清楚。
Fig1：结肠miR-223表达增加与IBD和结肠炎期间的活跃炎症相关
在肠道炎症期间，有各种白细胞群体显著流入发炎的肠道，引发组织损伤。为了确定与炎症环境相关的特异性miRNAs，使其成为新的治疗靶点。通过针对IBD患者的粘膜活检中筛选miRNA，发现miR-223是一种已知的髓系特异性miRNA，在活动性炎症中表达显著增加(图1A)。在未炎症小鼠结肠中给药上皮刺激物DSS可以显著诱导miR-223的表达(图1B)。值得注意的是，这种诱导先于炎症的组织反应(治疗后第2天)，并预示着早期髓样炎性流入(图1 C)。为了研究miR-223的诱导是否是组织内白细胞与浸润免疫细胞诱导基因表达的结果，作者在造模开始时用抗体消耗中性粒细胞(抗ly6g)或单核细胞(抗ccr2)。值得注意的是，中性粒细胞减少可显著降低miR-223表达(35%)，而单核细胞减少可将miR-223表达(67%)降低至未炎症对照组的水平(图1 D)。因此，急性结肠炎中miR-223的最初来源是浸润的中性粒细胞和单核细胞。这些数据为评估miR-223在实验性结肠炎中的生物学功能提供了理论依据。基于在IBD活检和临床模型中miR-223增加，作者通过对miR-223-/y小鼠进行一系列DSS-结肠炎实验来验证这一假设。即在活跃的肠道炎症过程中miR-223的增加发挥了作用。虽然miR-223-/y小鼠在基线时没有出现任何异常的结肠炎症，但通过体重减轻和疾病活动指数测量，在结肠炎期间，与野生型小鼠相比，它们的疾病严重程度显著增加(图1,E和F)。在第3天，miR-223-/y小鼠出现结肠溃疡和隐性出血显著增加，此时野生型小鼠只出现轻微的组织学炎症，没有明显的溃疡(图1g)。增强的结肠炎对应着结肠所有组织病理学指标的显著增加，包括炎症浸润和整体组织损伤(图1,G-I)。Fig2：造血功能缺乏miR-223增加DSS-结肠炎的易感性
虽然作者的数据描述了miR-223在控制肠道炎症方面的重要作用，但miR-223-/y小鼠是一种全身半合子基因敲除株，不能确定该表型中有髓系来源的miR-223。为了解决这个问题，作者像前面描述的那样产生了BM嵌合动物，以调查造血和基质/放射耐药miR-233在协调肠道炎症中的相对表达。数据表明，与对照组(WT→MIR-223-/y受体；图2，A-D)相比，DAI、体重减轻、结肠缩短和组织学指标的增加表明，造血源性MIR-223(MIR-223-/y WT受体)是驱动加重的结肠炎。miR-223在骨髓来源的外向中性粒细胞和单核细胞中表达最高，这些细胞尚未在组织内成熟。因此，数据表明，活动性IBD和实验性结肠炎患者的结肠miR-223的增加来源于浸润的髓细胞。 Fig3：在结肠炎发病期间，miR-223-/y小鼠骨髓浸润和IL-1β表达增加
为了进一步剖析导致miR-223-/y小鼠DSS-结肠炎加重的造血细胞群，作者评估了D结肠炎早期(第0-2天)的细胞浸润性。在miR-223-/y小鼠中，组织炎症和组织损伤的增加伴随着中性粒细胞和单核细胞的结肠内流增加，尽管组织巨噬细胞频率正常(图3，A-D)。与以前的文章类似，CD11C+树突状细胞也略有下降(图3E)。为了进一步研究miR-223-/y小鼠DSS-结肠炎加重的致病机制，作者评估了早期疾病(第2天)细胞因子的表达模式。与WT对应的相比，IL-1β的表达增加是miR-223-/y小鼠结肠的主要细胞因子表型(图3F)。最后，研究了中性粒细胞和单核细胞趋化因子的表达，并证明了IL-1β诱导的趋化因子CXCL1、CXCL2和CCL2在miR-223-/y结肠中显著上升，并与中性粒细胞和单核细胞的增强相对应(图3.G-I)。 Fig4：DSS-结肠炎期间miR-223-/y小鼠中NLRP3炎症体活性增加
髓源性miR-223调节肠道炎症以及早期结肠炎反应的主要表型是增强IL-1β释放的发现，作者接下来研究了miR-223的靶mRNAs：NLRP3的作用。为了确定miR-223缺陷对NLRP3炎症小体功能的功能性影响，观察到结肠炎后，miR-223-/y小鼠结肠中的IL-1β蛋白与野生型小鼠相比增加(Fig. 4B)。接下来作者检测了结肠炎小鼠全结肠中NLRP3蛋白的表达。与野生型小鼠相比，miR-223-/y小鼠的NLRP3蛋白表达和分泌的IL-1β表达增加(图4 C)。接下来，通过来自WT或miR-223-/y小鼠的BMDMs以引发炎症体的形成(LPS处理)并评估IL-1β蛋白的分泌(用ATP激活后)。与WT细胞相比，来自miR-223-/y小鼠的活化BMDM显示NLRP3蛋白和成熟IL-1β的表达增加(图4 D)。尽管miR-223缺陷不影响IL-1β、IL-18或TNF的mRNA表达(图4，E–G)，但与WT细胞相比，miR-223-/y BMDM分泌更高水平的成熟IL-1β和IL-18蛋白，而不改变TNF(图4，H–J)。这些数据证实了miR-223在调节肠髓细胞激活的关键成分NLRP3炎症体中的选择性和功能性作用。 Fig5：ccr2+炎性单核细胞抗体缺失可抑制mir-223-/y小鼠IL-1β表达和结肠炎
作者观察到单核细胞减少会抑制miR-223的表达(图1D)，以及miR-223-/y小鼠在结肠炎期间单核细胞和中性粒细胞增加，因此专门研究了单核细胞或中性粒细胞减少在结肠炎期间的影响。流式细胞术证实了任一单核细胞的选择性缺失(anti-CCR2;MC21)或中性粒细胞(图5 A、B)处理后。iNOS mRNA的缺失进一步证实了中性粒细胞的缺失(图5j)，但似乎对肠道炎症没有影响。然而，抗CCR2耗尽炎症单核细胞破坏结肠炎和组织损伤的组织学指标(图5,C和D)。与之前的研究一致，CCR2+单核细胞耗尽进一步降低miR-223-/y小鼠结肠IL-1β水平(图5e)。我们证明，在CCR2处理后，IL-1β mRNA被抑制(图5f)， IL-1β诱导基因IL-6和CXCL1的转录本也被抑制。重要的是，TNF mRNA的表达在抗ly6g和抗ccr2组中是相似的，表明单核细胞来源的IL-1β在miR-223-/y小鼠中驱动增强的结肠炎病理中具有选择性作用(图5,G-I)。Fig6：阻断NLRP3炎症小体或IL-1β可消除miR-223-/y小鼠在DSS-结肠炎期间增强的病理情况
接下来，作者研究了NLRP3炎症小体或IL-1β的选择性药物阻断是否会直接限制miR-223-/y小鼠的结肠炎。结肠炎期间，miR-223-/y小鼠分别接受NLRP3抑制剂MCC950或IL-1受体拮抗剂anakinra治疗。如图6 A-D所示，两种治疗方案均显著减轻了结肠炎的临床症状，包括体重减轻、DAI和结肠长度。MCC950和anakinra进一步抑制了组织病理学指标(图6,E和F)。还观察到结肠单核细胞和中性粒细胞频率低于DSS处理的WT小鼠(图6,G和H)。最后，尽管炎症细胞因子TNF和IL-6未发生改变，但治疗后结肠IL-1β显著降低(图6,I-K)。因此，NLRP3激活的增强和随后成熟的IL-1β的增加是miR-223-/y小鼠实验性结肠炎增强的原因。 Fig7：Mir-223靶基因敲除小鼠(Nlrp3m223del)的建立及其体内外功能评价
前期研究miR-223是NLRP3表达的关键负调控因子。为了在体内测试这种相互作用的重要性，作者建立了敲除小鼠，有条件地敲除了NLRP3-3’UTR的92个碱基，包括miR-223靶点。与现有的干扰miR-223的模型，即半合子敲除miR-223-/y小鼠或移植了表达miR-223骨髓的小鼠相对比。NLRP3-3’非编码区的这种缺失有可能影响区域的折叠，在该区域没有发现结构基序。因此，miR-223消除NLRP3抑制可能是该品系小鼠的主要功能作用。为了确定miR-223对NLRP3的绝对调控，作者分析了中性粒细胞中NLRP3的表达和NLRP3炎症小体的活性。LPS和黑霉素刺激Nlrp3m223del小鼠，激活NLRP3炎症小体。与野生型相比，黑霉素和LPS刺激的敲除中性粒细胞(del/del)的NLRP3表达持续增加，与野生型对照相比，纯合敲除的中性粒细胞中成熟IL-1β的产生显著增加(图7 B)，TNF无显著差异(图7 C)。综上所述，这些数据证实了该项目产生的小鼠中NLRP3不再被髓系来源的miR-223抑制。接下来作者在体内测试了其对实验性结肠炎的功能影响，发现NLRP3m223del小鼠更容易发生结肠炎，这表明除了体重减轻增加外，浸润性中性粒细胞增加，结肠长度减少，组织学评分更高(图7,D-H)。因此，作者的整体数据认为，在体内，NLRP3是miR-223的靶点，这是肠道炎症的一个关键决定因素。
Fig8：纳米颗粒传递mir-223模拟物可减弱实验性DSS-结肠炎
靶向异常炎症通路的小分子是IBD治疗研究的重点。基于作者的数据，试图研究在实验性结肠炎中使用miR-223模拟物作为一种新的治疗干预措施的疗效。人工合成的小鼠miR-223模拟物以纳米粒脂乳液(静脉;DSS处理后第1天和第3天)。作为相关对照，使用了在秀丽隐杆线虫中严格表达的相应miRNA对照(cell - mir -239b)。如图8 A所示，在疾病高峰期间(DSS后第6天)，合成的miR-223模拟物的治疗干预使结肠miR-223表达增加了3倍。同时伴有明显的dss -结肠炎保护作用，表现为隐蔽性出血减少、体重减轻和水肿(图8,B-E)。此外，mmu-miR-223模拟治疗在mRNA和蛋白水平上抑制了miR-223靶点NLRP3(图8,F和G)。同时，IL-1β蛋白减弱，IL-1β、IL-6、TNF和CXCL1 mRNA转录被抑制(图8,H和I)。总之，这些数据证实了miR-223在异常肠道炎症过程中的关键作用，并代表了使用miRNA模拟治疗实验性IBD的治疗研究的原理证明。
1.作者报道了miR-223通过抑制NLRP3炎症小体来限制肠道炎症。在活动性IBD患者和临床前肠道炎症模型的肠道活检中，miR-223增加。MiR-223 -/y小鼠表现为加重的骨髓驱动实验性结肠炎，临床、组织病理学和细胞因子读数升高。2.在机制上，随着IL-1β的升高，NLRP3炎症小体表达增强在miR-223缺乏的结肠炎开始期间是一个主要特征。CCR2+炎性单核细胞的缺失和IL-1β或NLRP3的药物阻断可以消除这种表型。3.纳米颗粒介导的miR-223过表达降低了实验性结肠炎、NLRP3水平和IL-1β的释放。
好啦，本期的精品文献导读就到这里
对我们的文章感兴趣的朋友们
记得关注我哦！
我们下次再见，么么哒！
流式检测|病理检测|动物模型|实验服务|分子操作|免疫相关检测
免费热线：18570028002
官网：http://www.uptbio.com
2023-04-28 13:56:27
湘公网安备