今天普拉特泽生物继续跟大家一起解读国自然基金热门课题——乳酸化研究高分文献《Histonelactylationdrives oncogenesis by facilitating m6A reader protein YTHDF2 expression in ocular melanoma》，文章是2021年在Cancer Letters杂志上发布的，影响因子为17.906。

    这是1篇比较经典的乳酸化修饰文章，不少文章在解读医学课题中的乳酸化时，都选了这篇文章，为什么这篇文章会从众多乳酸化文章中脱颖而出呢？从题目就可以看出来：其一文章结合2个目前国自基金申请比较热的点，一个m6A，另一个则是今天的主角-乳酸化。其二会是什么呢？让我们一起从文章中去寻找答案。

    Fig 1 组蛋白乳酸化水平升高与眼部黑色素瘤患者预后不良相关

    临床样本的免疫荧光染色显示，眼部黑色素瘤组织中的整体乳酸化水平明显高于正常黑素细胞组织（p<0.05）（图1a，b）。更高的整体乳酸化水平预示着更早的复发和增强的癌症侵袭性（log-rank检验，p<0.05）（图 1c，d）。同样的，western blot分析显示，大多数眼部黑色素瘤细胞系的整体乳酸化水平也升高了（图1e，f）。免疫荧光染色显示乳酸化蛋白主要定位于细胞核，而免疫印迹检测的主要条带接近17 kDa。对乳酸化蛋白免疫沉淀后进行银染色质谱（MS），结果显示该条带为组蛋白H3（图1g）。因此，作者决定研究上述现象是否由H3K18la引起。同样，与正常黑色素细胞组织相比，眼部黑色素瘤组织中H3K18la水平与整体乳酸化水平的趋势相同（图1i，j），H3K18la水平升高表明预后较差（log-rank检验，p<0.05）（图1k，l）。在大多数眼部黑色素瘤细胞系中也观察到更高的H3K18la水平（图1e，h）。western blot检测证实了眼部黑色素瘤组织中整体乳酸化水平和H3K18la水平的升高（图1m）。这些数据表明，很大一部分眼部黑色素瘤的特征是组蛋白乳酸化水平升高，可能参与了眼部黑色素瘤的发生。

    Fig 2 抑制组蛋白乳酸化可抑制眼部黑色素瘤的发生

    为了评估组蛋白乳酸化抑制是否能减弱眼部黑色素瘤的发生，作者降低了肿瘤细胞内的整体组蛋白乳酸化水平。使用糖酵解抑制剂（2-DG）和肟酸，以及乳酸脱氢酶（LDHA和LDHB)的siRNA，以减弱乳酸生成和组蛋白乳酸化（图2a）。在眼部黑色素瘤细胞（OCM1和CRMM1细胞）中，两种糖酵解抑制剂均显著降低了细胞内乳酸（图2b，c）以及整体乳酸化和H3K18la水平（图2d，e）。LDHA缺陷（图2f）或LDHB缺陷（图2f）的眼部黑色素瘤细胞都没有出现整体组蛋白乳酸化的显著减少。然而，同时沉默LDHA和LDHB（图2f）显著损害了组蛋白乳酸化，还显著抑制了细胞增殖（图2g-j）和迁移（图2k，l）。此外，向LDHA/LDHB缺陷细胞中添加乳酸钠（Nala）成功地提高了组蛋白乳酸化水平（图2f），并部分恢复了细胞增殖（图2g-j）和迁移（图2k，l）。

    Fig 3 对组蛋白乳酸化的潜在下游靶点的鉴定

    为了揭示组蛋白乳酸化在基因表达中的调控作用，作者使用抗H3K18la抗体进行了染色质免疫共沉淀，然后进行测序（ChIP-seq）。ChIP-seq数据显示，H3K18la在启动子区域富集（图3a）。KEGG分析显示，这些H3K18la特异性基因在代谢途径和肿瘤相关途径中富集（图3b），表明组蛋白乳酰化在肿瘤发生中具有调控作用。通过将ChIP-seq数据(GEO登录号：GSE156674)与使用糖酵解抑制剂处理&不处理的细胞转录组(GEO登录号：GSE156675)以及正常&肿瘤细胞转录组(GEO登录号：GSE137675)的RNA测序(RNA-seq)数据相结合，鉴定出4个抗h3k18la -ChIP靶基因，这些基因在糖酵解抑制剂处理的细胞中mRNA水平显著降低，在肿瘤细胞中高表达（图3c）。其中YTHDF2启动子上的H3K18la信号显著富集（图3d）。ChIP-qPCR检测也表明，H3K18la在YTHDF2启动子区域富集，而糖酵解抑制剂减少了这种富集（图3e，f）。此外，ChIP-qPCR检测显示，经糖酵解抑制剂处理后，EP300-组蛋白乳酸化writer在YTHDF2启动子上的结合水平显著降低（图3g，h）。经糖酵解抑制剂处理后，YTHDF2的蛋白（图3i，j）的表达水平均显著降低。综上所述，YTHDF2的转录受到Y3K18la的正向调控。

    Figure 4-5 YTHDF2是一种新的眼部黑色素瘤致癌基因

    由于YTHDF2可以被H3K18la直接调控，作者接下来探讨了在眼部黑色素瘤中的功能。YTHDF2在眼黑色素瘤细胞系中在RNA（图4a，b）和蛋白水平（图4c、d）均高表达。此外，免疫荧光染色显示，与正常黑素细胞组织相比，YTHDF2在眼部黑色素瘤组织中的表达显著上调（p<0.05）（图4e，f），且YTHDF2的表达量更高与不良预后呈正相关（log-rank检验，p<0.05）（图4g，h）。基因表达谱交互式分析（GEPIA）数据库证实，高YTHDF2水平与较差的预后相关（图4i）。在成功敲除YTHDF2后（图5a，b的细胞中进行CCK-8检测，结果显示与对照组细胞相比YTHDF2敲除细胞数量显著减少（图5c，d)。平板集落形成实验和transwell实验发现，下调YTHDF2基因抑制了肿瘤细胞集落的形成和迁移(图5e-h)。综上所述，这些数据表明YTHDF2在眼部黑色素瘤中是作为一种致癌基因而存在的。

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    Fig 6 组蛋白乳酸化通过m6A readerYTHDF2促进癌症

    在确定YTHDF2的表达受H3K18la调控后，作者想确定组蛋白乳酸化诱导的肿瘤抑制是否可以通过获得YTHDF2来挽救。在眼部黑色素瘤细胞中过表达YTHDF2后（图6a），糖酵解抑制剂的抗癌作用包括细胞生长（图6b、c）、集落形成（图6d、e）和迁移（图6f、g）部分受损。此外，YTHDF2在眼部黑色素瘤细胞中的过表达加速了肿瘤的发生，这进一步表明了YTHDF2的致癌功能的增加。综上所述，H3K18la通过YTHDF2部分促进了肿瘤的发生。

    Fig 7-8 PER1和TP53可能是与YTHDF2相关的关键候选基因

    通过结合MeRIP-seq数据（GEO登录号：GSE137675）与糖酵解抑制剂处理细胞RNA-seq数据（GEO登录号：GSE156675），作者发现13个基因（3‘UTR含m6A峰）在糖酵解抑制剂处理细胞中显著增加且与 TCGA数据库中YTHDF2的表达呈负相关（图7a)）。具体来说，是肿瘤抑制基因PER1和TP53与TCGA数据库中的YTHDF2呈负相关（图7b，c），因此，作者假设YTHDF2通过结合PER1和TP53各自的m6 A位点来促进它们的降解。

    MeRIP-seq和meCLIP-seq数据（GEO登录号：GSE137675）显示，PER1和TP53在3‘UTR区域有m6 A位点（图7d，e）。MeRIP-qPCR检测发现，与IgG组相比，m6A特异性抗体组中PER1和TP53 mRNA得到了富集（图7f，g）。RIP-qPCR分析显示，PER1和TP53 mRNA主要与YTHDF2相互作用（图7h，i）。YTHDF2敲低显著上调了PER1和TP53 蛋白水平（图7j）。此外，作者还观察到PER1和TP53被组蛋白乳酸化诱导剂（Nala）下调（图7k）。接下来，作者设计回复实验，观察沉默PER1和TP53是否会影响YTHDF2的敲低作用。沉默PER1和TP53细胞后，部分恢复了YTHDF2敲低导致的细胞增殖（图8b-e）和迁移（图8f，g）受损。综上所述，这些数据表明，异常的YTHDF2-PER1/TP53轴有助于眼部黑色素瘤的肿瘤进展。

    小编认为原因有三：

    一是文章开头小编就提及了的作者选择了目前爆火的研究机制m6A+乳酸化，强强联手，谁不想1篇文章熟悉多个热点呢；

    其二检测手段多样化，从基本的分子/表型检测到CHIP/RIP/MeRIP再到MeRIP-seq/ChIP-seq/RNA-seq，遇事不决就做测序，也是很壕很任性；

    其三流程图也是加分项，试剂的添加看不懂，流程图来1套（如图2A）；测序看不懂，流程图来1套（如图3C、7A）；整个设计看不懂，最后再整1套全文机制图（如图8H），高低给你弄的明明白白。谁不喜欢这么有钱还懂事的作者呢？

    好啦，今天的乳酸化就分享到这里，祝大家新年新气象~我们下个国自基金热点课题见！