双荧光素酶报告基因实验操作注意事项由普拉特泽生物分子检测平台与《春风学院》给大家总结分享，文尾附上视频教程供大家学习。《春风学院》为普拉特泽生物旗下唯一的科研培训品牌，为广大科研人员提供线上下6大国自然专题精讲、15项常用实验技能讲解与实操培训课程。同时，普拉特泽生物更承接线下双荧光素酶报告基因检测等各类生物实验外包服务，铺平你的科研路~

   好了话不多说我们详细看看，双荧光素酶检测实操过程中有哪些注意事项！

   1、报告基因检测受多种因素影响(载体状态细胞状态、转染量、转染效率、裂解效率、加样精度、检测过程等)，因此同批次样品检测值也可能出现浮动。所以实验一般需要做3个或者3个以上复孔，并且引入另一个报告基因作为内参。

   2、细胞培养时间不宜过长，12-36h内最好;长时间培养后，细胞难裂解。

   3、双荧光素酶报告基因的载体选择：

   （1）萤火虫荧光素酶建议选取pGL-3或pGL-4的载体或自己构建相应的载体;

   （2）海肾荧光素酶建议选取phRL-TK或pGL-4代载体或自己构建相应的载体。建议海肾载体不使用强启动子(如SV40、CMV)，而选用中等强度的启动子(如TK)。

   4、双荧光素酶报告基因的载体比例:根据实验具体情况调整。建议作一个预实验来调整(董火虫载体与海肾载体比例分别用1:101:201:501:100)，黄火虫荧光素酶检测发光值大于海肾

荧光素酶发光值的比例较好。

   5、最适反应温度室温(20-22℃)。各个组分(细胞裂解产物，底物工作液等)都需要调整到室温。

   6、双荧光素酶反应体积:20uL(细胞裂解产物)-100uL(黄火虫荧光素酶底物)-100uL(海肾荧光素酶底物)，底物量可根据实际情况调整，但一定要保证底物过量，不然会造成检测结果出现大的偏差。

   7、细胞裂解产物存放：常温不超过6小时；-20℃一个月；-80℃半年

   8、裂解产物与底物混合(手动加样):要求混合快速、混合时间一致，避免荧光素酶衰变的影响。

   9、发光半衰期：

   （1）单荧光素酶检测试剂盒(E1500)，萤火虫荧光素酶的发光半衰期约12 min

   （2）双荧光素酶检测试剂盒(E1910)，黄火虫荧光素酶的发光半衰期约9 min，海肾荧光素酶的发光半衰期约2 min

   10、检测结果：

   检测前应检测引板或空管的发光值，作为仪器发光背景值，Modulus多功能检测仪的仪器背景值应小于100；样品检测发光值应该远大于仪器背景值，例如10000。如果样品发光值过于接近仪器背景值，说明样品中荧光素酶过少，需要考虑转染量、转染效率、裂解效率等因素。

         好啦，关于双荧光素酶实验的注意事项我们就讲完啦，还有不懂的同学欢迎随时留言哦，需要视频教程的同学请点击：《双荧光素酶原理+实操》