双荧光素酶报告基因实验操作步骤由普拉特泽生物旗下科研培训品牌《春风学院》为大家总结分享，从样本制备、与双报告基因检测两个方面给大家详细解说，普拉特泽承接包括双荧光素酶实验线下生物实验外包服务，同时春风学院也提供线上下生物医学实验技能培训，铸就广大实验人员医学科研的金身。

   一、样品准备

   1、质粒转染细胞

（1）细胞铺板:将细胞按50%的密度接种到细胞培养12孔板内。

（2）转染:16h左右细胞约70%时转染黄光素酶报告基因质粒，每个样品设置3个复孔。首先设计四组:

空白组（转染试剂+细胞）

质粒组

质粒+miRNA NC组

质粒+miRNA mimics组
    2、其他准备工作

（1）配制质粒组:按照每空50ng质粒，同时每孔20ul无血清培养基计算需用量，标记为A。

（2）配制miRNANC/mimics:miRNANC/mimics的终浓度为20 nM，同时每孔20ul无血清培养基计算需用量，分别标记为B、C。

（3）配制对应转染试剂:按照每孔05ulL转染试剂同时每孔20uL无血清培养基计算需用量，标记为D。稀释好的四组试剂常温孵育5 min。

（4）将稀释好的质粒DNA和miRNAmimics分别和对应转染试剂混匀，常温孵育20 min。

（5）将上一步中试剂对应加入孔中。

（6）转染6h后，换新鲜完全培养基。

   二、双报告基因检测

（1）质粒共转染36-48h后，弃去培养基，用100uL1XPBS清洗细胞。

（2）倾斜12孔板，吸干剩余的PBS。

（3）离子水将5XPLB(裂解液)稀释成1XPLB(现配现用)，使用前放到常温。

（4）每孔加50uL稀释好的1XPLB，置摇床振摇20-30 min以保证裂解缓冲液完全裂解细胞。

（5）选用白色不透光的96孔酶标板中每孔加步骤4的上清液10uL，加入100uL预先混好的 Luciferase Assay ReagentII，2s后测数据，检测荧光素酶反应强度。注意此步需在避光条件下进行。

（6）测定结束后，每孔添加100uL预先混好的Stop&Glo Reagent，静止2s后，测数据，检测内参海肾荧光素酶反应强度。

（7）记录读数:每个样品会有3个数值:RLU1-黄火虫荧光素酶反应强度RLU2-内参海肾荧光素酶反应强度计算两组数据比值，即RLU1/RLU2。

（8）分析数据:比较1、2组可以发现由于对照组未转染质粒，因此检测不到荧光素酶反应强度。比较3.4组，由干转染microRNAmimics进行microRNA的过表达，黄光素酶的活性降低，提示microRNA可能参与抑制靶基因的表达，需要结合定点突变等方法进一步确定 miRNA与靶基因3UTR的作用位点。

   好的，那么双荧光素酶检测的实验操作步骤我们就分享完啦，还没有学会的同学可以点击：《双荧光素酶原理+实操》观看视频教程学习哦。