原位杂交操作步骤由普拉特泽生物为大家总结分享，我们常见的原位杂交主要是RNA原位杂交与荧光原位杂交。普拉特泽生物病理实验平台为给大家详细分享FISH原位杂交的实验操作步骤，一起来看看吧！（DNA原位杂交少见，如需要实验步骤可留言后期分享哦）

        以癌组织为例，实验原理步骤如下：

        原位杂交的实验原理我们有提到过：用已标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸中的互补序列杂交, 从而对组织细胞中的核酸进行定性、定位和相对定量分析。基本原理--碱基互补配对原理。

        癌组织原位杂交实验步骤：

        1. 将准备做原位杂交的样本常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。

        2. 玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。

        3. 石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。

        4. 暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1 ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃或室温消化3--30分钟（视标本新旧、厚薄自行调整）。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。

        5. 后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.2-7.6），含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。

        6. 原位杂交的预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。

        7. 杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。

        8. 杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。

        9. 滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗。

        10.滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。

        11.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。

        12.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。

        13.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。

        14.苏木素复染，充分水洗。

        15.酒精脱水，二甲苯透明，封片。

        好了，关于FISH实验的详细操作步骤我们就讲完了，但是大家要注意的是，不同的组织样本做原位杂交的实验方案与步骤均会有相应的调整，准备进行实操的同学需要研究学习更多的实验案例来制定合适的方案以得到最好的实验结果。当然啦，普拉特泽生物随时在为您提供原位杂交代做服务哦。更多是原位杂交实验案例可直接联系客服桃子姐姐：18570028002 领取观看哦！