荧光原位杂交操作步骤由普拉特泽生物总结分享，上期我们分享了RNA原位杂交的详细操作步骤，感兴趣的同学可以回去复习哦。普拉特泽生物实验室专业承接荧光原位杂交等组织检测实验，经验丰富，质量可靠，那现在我们就来看看以某组织样本为例，FISH检测的实验原理与详细步骤吧！

        荧光原位杂交技（FISH）原理：是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位。

荧光原位杂交技（FISH）实验步骤：

1.切片脱蜡水化。

2.通透
a.【1XPBS】清洗5 min；b.加入预冷的【通透液】（含0.5%TritonX-100的PBS），4°C静置5 min；c.弃去【通透液】后，加入【1XPBS】清洗5 min，3次。

3.探针检测

a.加入200 uL【预杂交液】，37°C封闭30 min；（预杂交液：将适量BlockingSolution与Pre-hybridizationBuffer按
照1：99混匀后，37℃孵育至透明澄清状态（约30 min）后，分装保存。在使用前，须在37℃气浴或水浴中孵育至澄清透明。）b.预杂交同时，将【杂交液】在37°C中预热；c.避光条件下，把2.5uL探针加入到100μl【杂交液】中；注：探针浓度可根据具体实验情况进行优化。杂交液配制：将适量BlockingSolution与HybridizationBuffer按照1：99混匀，37℃孵育30min后分装保存。在使用前，须先在37℃气浴或水浴中孵育30 min。杂交液颜色偏黄属于正常现象注：PrehybridizationBuffer（试剂A）和HybridizationBuffer（试剂B）从低温取出时可能有沉淀析出，属于正常现象。

d.弃去切片中的【预杂交液】，加入100uL含有探针的【探针杂交液】，避光，37°C杂交过夜。e.避光，42°C，【杂交洗液I】清洗3次，每次5 min，以降低背景信号；f.避光，42°C，【杂交洗液II】清洗1次；g.避光，42°C，【杂交洗液III】清洗1次；h.避光，【1XPBS】清洗，室温5min。注：所有指定温度的步骤，注意将相关试剂预热到对应实验所需温度后再使用。

4.DNA染色a.避光，【1XDAPI染色液】染色10 min，染色液用量以覆盖待杂交区域所有细胞为宜；b.避光，【1XPBS】清洗3次，每次5 min。(如组织有自发荧光，可增加步骤苏丹黑自发荧光淬灭剂进行淬灭。）

5.封片避光条件下，滴加封片剂用盖玻片密封，进行荧光检测。

        好啦，那关于荧光原位杂交详细的操作步骤到这里就结束啦，供大家学习参考。和RNA原位杂交一样，新手如果准备上手操作的话不建议操作照搬哦，不同的实验样本实验方案或许会有相应的调整，需要技术咨询的同学欢迎给客服留言，技术会一一详细解答，更有原位杂交外包需求的同学，普拉特泽随时为您服务哦！