亚硫酸氢钠测序（BSP）实验步骤由普拉特泽生物分享，亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶(C)都被转化为尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶则不变。通过设计针对甲基化序列的引物并进行聚合酶链反应(PCR)扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳分析，将符合预期的产物纯化回收连接T载体，进行阳性克隆测序即可获取某个特定基因区段内每个CpG位点的甲基化程度。普拉特泽生物表达检测平台长期为广大科研人员提供亚硫酸氢钠测序外包服务，本文咱们就一起来看看BSP实验的详细操作步骤吧~

  1、引物设计

  在GenBank上找到待检基因启动子区的原始序列，输入到“MethPrimer”软件中，输入启动子序列，选择“Pick primers for bisulfite sequencing PCR or restriction PCR ”，其他参数选择程序默认值，点击“Submit”，“MethPrimer”软件即可显示预测的启动子序列的CpG岛，及引物的相应位置，同时也显示设计的BSP引物。选择多对引物进行预实验，最终确定引物序列。

      2、基因组提取

  使用天根的TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒（实验步骤见PDF:TIANamp Genomic DNA Kit），分别提取各样本基因组。提供的细胞量要求大于10^6个。提取浓度在100-400 ng/μL之间，OD 260/280均在1.8-2.0之间，提取质量合格。

       3、亚硫酸氢钠修饰基因组DNA

  （1）将提取获得的基因组DNA 3 μg以无菌双蒸水稀释至50μl，然后加入NaOH （终浓度为0.2 M）在42℃水浴变性30 min。

  （2）依次加入30μl 10mM对苯二酚（氢醌）、520μl 3 M亚硫酸氢钠（pH=5.0要求精准）至上述水浴后混合液中，轻柔颠倒混匀。

  （3）加入200μl石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化；50℃避光水浴16h。

  4、修饰后DNA纯化回收

  修饰后的DNA使用纯化试剂盒进行过柱纯化，回收后用50µl无菌双蒸水溶解，并测定浓度。

  5、PCR扩增

       PCR引物设计、退火温度选择、Taq酶及Buffer的选择都会影响扩增的成败，需要不断优化。

     6、扩增产物回收

     将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，进行胶回收，步骤如下：在紫外灯下，切下包含目的片段的胶条。用天平称量总重量并减去空管的重量算出凝胶的重量，按100mg=100µL来计算凝胶的体积，并加入1倍凝胶体积的Binging Solution置于65℃水浴锅内将凝胶彻底融化。期间适当摇晃EP管，加快凝胶的溶解。

  将上述液体全部转移到滤柱内，13000转离心30S（可重复一次）。然后弃掉管内液体，向柱内加入500µL的WA Solution，13000转离心30S。弃掉管内液体，再向柱内加入500µL的Wash Solution，13000转离心30S（可重复一次）。然后空离3 min。将滤柱放置在一个新的1.5mL EP管中，室温晾干。最后在柱子内加入35 µL的ddH2O，静置5min，13000转离心90s。为了提高回收率，可将溶解的DNA再次加入柱子内离心一分钟。弃掉柱子，回收的即为扩增产物片段，并测定浓度。

  7、进行重组反应

  将回收的扩增片段与T克隆载体进行重组，完成回收目的基因与载体的重组过程。

      8、转化

  （1）将感受态细胞置于冰上（4℃）待其自然解冻后，取10 µl连接产物加入感受态细胞中，于冰上（4℃）放置30 min。

  （2）之后于42℃水浴中热击90 S，然后迅速置于冰上（4℃）放置2-3 min。

  （3）加入500µL不含抗生素的SOC培养基于37℃,225rpm振荡培养45 min。

  （4）3000转离心2 min，弃掉900µL的上清液，将管底的菌液吹打散开，加入到含有载体上对应抗性（氨苄或卡那等）的培养平板中，用灭菌的涂布器涂匀（涂布器的温度不能太高，以免烫死菌体），倒置于37℃恒温培养箱内过夜培养。

  9、克隆鉴定

  挑起平板多个克隆转化子进行菌落PCR，阳性克隆子再进行测序鉴定，保证最终拿到5个有效样品测序数据。

  好啦，那关于亚硫酸氢钠测序BSP测序的详细操作步骤咱们就讲到这里啦，是不是很细节呢？如果您还有什么实验问题或有BSP检测外包的需求欢迎随时咨询哦~