今天给大家带来一篇通过诱导多种细胞死亡方式，有急性抗肿瘤作用的药物研究论文。本文从芬瑞胺诱导细胞死亡的方式入手，探讨了芬瑞胺在未来的临床应用中，可扩展到肺泡横纹肌肉瘤的治疗。

正式开始前

我们先来了解下细胞的经典与非经典死亡方式的区别

细胞经典与非经典死亡方式附表

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下面跟着我一起来细品下这篇文章。

这是一篇将药物引起的多种细胞死亡方式一起进行研究的文章。

这是一篇不怎么搞机制研究，但把细胞生物学行为系统的纳入到检测范围中的文章。

这是一篇初看看不懂，细品有趣味，值得收藏学习的文章。

译：在小儿肉瘤中芬瑞胺诱导了一种新型动力依赖性细胞死亡

文章发表在大CDD杂志，2019年IF：10.717，Q1.

本文得出了以下几点结论：

1.芬瑞胺参与了一种新的细胞死亡形式，这是传统化疗药物无法利用的，这一事实使它成为治疗FP-RMS患者的一个有前途的组合伙伴。潜在的联合治疗药物可能是诱导典型的细胞凋亡或坏死性死亡，甚至是其他形式的细胞死亡，如自噬或铁死亡等。

2.芬瑞胺诱导的线粒体活性氧干扰了动力依赖性大细胞增多症的调节，导致细胞细胞质中的小泡积聚，这与FP-RMS细胞的强细胞毒性作用有关。

3.因为芬瑞胺已经在儿童临床使用，并且在短期和长期治疗方案中只有中度副作用，研究结果可能会刺激芬瑞胺在未来的临床应用扩展到FP-RMS治疗。

几个背景介绍：

芬瑞胺：一种合成的类维生素A衍生物，能够结合视黄酸受体(RAR)诱导细胞死亡，芬瑞胺对T-ALL细胞株不仅具有急性抗肿瘤作用，而且具有长期抗肿瘤作用。芬瑞替尼抑制CCRF-CEM白血病细胞DES活性呈剂量和时间依赖性，会导致细胞内源性dhCer含量增加。

肺泡横纹肌肉瘤(aRMS)：一种高度恶性的儿童恶性肿瘤，其特征是特异的染色体易位，主要编码致癌转录因子PAX3-FOXO1，因此也被称为融合阳性RMS (FP-RMS)。

之前，作者已经发现芬瑞胺(维甲酸对羟基苯胺)可以影响PAX3、FOXO1表达水平和FP-RMS细胞活力。但芬瑞胺的作用模式还没有更多的研究。接下来文章就从芬瑞胺的作用模式入手，对芬瑞胺诱导细胞死亡的形式展开了研究。

因为之前论证了芬瑞胺诱导的细胞死亡与PAX3-FOXO1水平的降低有关。由于PAX3-FOXO1的表达是存活所必需的，作者首先探讨了芬瑞胺的作用是否依赖于PAX3-FOXO1融合蛋白的缺失。

作者构建了一个多西环素诱导的针对内源性PAX3-FOXO1的慢病毒shRNA载体和一个EF1启动子驱动的载体，在Rh4细胞中表达PAX3-FOXO1(P3F mut)的shRNA不敏感变体。经shRNA诱导后，内源性P3F蛋白水平降低到20%左右，而异位PAX3-FOXO1的水平与内源性蛋白的水平相匹配。生理学上，PAX3-FOXO1的异位表达降低了cleaved PARP的水平，提示这可以挽救细胞凋亡。然而，出乎意料的是，尽管外源性PAX3-FOXO1蛋白水平保持不变，但通过WST-1实验和western blotting检测，异位PAX3-FOXO1并没有保护非尼维酯诱导的细胞死亡(图1a)。这表明，芬瑞胺治疗后诱导细胞凋亡与PAX3-FOXO1水平的降低有关，而在PAX3-FOXO1持续表达的条件下，芬瑞胺诱导了另一种细胞死亡模式。

为了进一步探索，作者分别用了药理学和遗传学的方法评估了芬瑞胺介导的细胞毒性的相关性：

药理学：没有一个特定的细胞死亡抑制剂能够拯救细胞死亡(图1b)，这表明诱导细胞凋亡，坏死，铁死亡或自噬在芬瑞胺诱导的细胞死亡中起主要作用。然而，有趣的是，DFO几乎完全挽救了细胞活力。FS和DFO都是活性氧(ROS)的清除者，FS是脂溶性的，在铁死亡过程中具有膜脂过氧化的保护作用，而DFO具有更广泛的ROS保护活性，这表明更广泛的ROS物种可能在铁死亡过程中发挥重要作用。

遗传学：作者在两种细胞系中使用CRISPR/Cas9系统敲除凋亡/坏死/自噬途径的关键基因，从而产生死亡途径消融的肿瘤细胞。在Rh4细胞中，芬瑞胺处理后，BAX和BAK的联合敲除几乎完全抑制了caspase7和PARP-1的切割，而在Rh30细胞中，PARP-1和caspase-9的切割受基因操作的影响较小，提示其他凋亡途径也参与其中。BAK/BAX/RIPK1的三次敲除也得到了类似的结果（图1c）。接下来，作者测定芬瑞胺治疗后所有敲除细胞的剂量-反应曲线。与药理学方法一致，与野生型细胞相比，缺失型细胞对细胞死亡的挽救作用不显著，这在三次敲除的细胞中更为明显（图1d）

这些结果表明，虽然芬瑞胺参与了一些凋亡特征，包括caspase激活，但当凋亡被阻断时，细胞主要执行一种替代的死亡途径。

基于ROS抑制剂DFO从非尼维酯诱导的细胞死亡中拯救FPRMS细胞的能力（图1b），作者想知道ROS是否可能与诱导细胞死亡有关。

首先，作者观察到芬瑞胺处理20小时后泛ROS探针CellRox在核周有很强的ROS积累（图2a）。同时流式细胞术表明，ROS水平增加了约2.5倍。用线粒体特异性ROS探针(MitoSox)染色的细胞也显示类似的增加了约3倍（图2b）指示至少有一部分芬瑞胺诱导的活性氧来源于线粒体。为了确定ROS诱导细胞死亡的相关性，作者使用了不同的ROS抑制剂。活性氧水平的降低程度各不相同（图2c、d和补充图3B）。与这些清除作用相一致的是，与DFO(图1b)相同，米托泰也能够完全抑制芬瑞胺诱导的细胞死亡(图2d)，而维生素C和FS的作用很小。这些结果表明，芬瑞胺诱导线粒体活性氧，参与诱导细胞死亡。为了评估其他ROS来源的作用，如脂质第二信使或内质网，通过使用抑制丝氨酸棕榈酰转移酶(myriocin)和内质网氧化酶(ERO1)的抑制剂，并与米托泰进行比较，用芬瑞胺共处理细胞，并评估了细胞活力(图2e)。除MitoTempo外，这些抑制剂均不能挽救芬瑞胺介导的细胞死亡，提示鞘脂途径和内质网都不是ROS的相关来源。然而，用MitoTempo完全解救，表明线粒体是芬瑞胺诱导的ROS的来源。

活性氧产生的主要来源之一是MRC。由于MRC是细胞产生ATP的主要来源，任何干扰对肿瘤细胞都是致命的，并降低线粒体膜电位（Δψm）。因此，作者下一步就评估了芬瑞胺诱导的线粒体活性氧是否由一种MRC复合物产生。

作者用芬瑞胺和不同的抑制剂联合处理Rh4细胞，靶向MRC的五种复合物，并测量产生的ROS量。针对复合物I（鱼藤酮）、III（抗霉素）、IV（叠氮化钠）和V（CCCP）的抑制剂不会导致ROS水平的降低。相反，复合物II的抑制剂，即TTFA和carboxin显著减少Rh4和Rh30细胞中的ROS生成（图3a，b）。这些结果表明芬瑞胺产生活性氧的主要靶点位于MRC复合体II的下游。

为了进一步表征芬瑞胺诱导的细胞死亡，作者接下来使用电子显微镜(EM)在超微结构水平上研究了形态学变化。

用芬瑞胺单独或联合z-vad处理Rh4和Rh30细胞48小时。结果显示芬瑞胺在细胞质内诱导了一个巨大的空泡化，与z-vad结合后，空泡化进一步增强。液泡大小不一，透光，只有一层膜，不代表自噬体。这些发现进一步强化了作者的假设，即芬瑞胺能够触发多种类型的细胞死亡。

因为通过电镜观察到的透明相囊泡的特征与大肌体一致，并使人联想到与内质体积累相关的细胞死亡形式。因此，作者又研究了芬瑞胺诱导的细胞死亡是否与大细胞吞噬功能紊乱或内吞作用有关。通过流式检测发现芬瑞胺确实诱导了AO和LY的摄取（>4倍的增加，图4b）。

本文得出了以下几点结论：

1.芬瑞胺参与了一种新的细胞死亡形式，这是传统化疗药物无法利用的，这一事实使它成为治疗FP-RMS患者的一个有前途的组合伙伴。潜在的联合治疗药物可能是诱导典型的细胞凋亡或坏死性死亡，甚至是其他形式的细胞死亡，如自噬或铁死亡等。

2.芬瑞胺诱导的线粒体活性氧干扰了动力依赖性大细胞增多症的调节，导致细胞细胞质中的小泡积聚，这与FP-RMS细胞的强细胞毒性作用有关。

3.因为芬瑞胺已经在儿童临床使用，并且在短期和长期治疗方案中只有中度副作用，研究结果可能会刺激芬瑞胺在未来的临床应用扩展到FP-RMS治疗。

几个背景介绍：

芬瑞胺：一种合成的类维生素A衍生物，能够结合视黄酸受体(RAR)诱导细胞死亡，芬瑞胺对T-ALL细胞株不仅具有急性抗肿瘤作用，而且具有长期抗肿瘤作用。芬瑞替尼抑制CCRF-CEM白血病细胞DES活性呈剂量和时间依赖性，会导致细胞内源性dhCer含量增加。

肺泡横纹肌肉瘤(aRMS)：一种高度恶性的儿童恶性肿瘤，其特征是特异的染色体易位，主要编码致癌转录因子PAX3-FOXO1，因此也被称为融合阳性RMS (FP-RMS)。

之前，作者已经发现芬瑞胺(维甲酸对羟基苯胺)可以影响PAX3、FOXO1表达水平和FP-RMS细胞活力。但芬瑞胺的作用模式还没有更多的研究。接下来文章就从芬瑞胺的作用模式入手，对芬瑞胺诱导细胞死亡的形式展开了研究。

本文得出了以下几点结论：

1.芬瑞胺参与了一种新的细胞死亡形式，这是传统化疗药物无法利用的，这一事实使它成为治疗FP-RMS患者的一个有前途的组合伙伴。潜在的联合治疗药物可能是诱导典型的细胞凋亡或坏死性死亡，甚至是其他形式的细胞死亡，如自噬或铁死亡等。

2.芬瑞胺诱导的线粒体活性氧干扰了动力依赖性大细胞增多症的调节，导致细胞细胞质中的小泡积聚，这与FP-RMS细胞的强细胞毒性作用有关。

3.因为芬瑞胺已经在儿童临床使用，并且在短期和长期治疗方案中只有中度副作用，研究结果可能会刺激芬瑞胺在未来的临床应用扩展到FP-RMS治疗。

几个背景介绍：

芬瑞胺：一种合成的类维生素A衍生物，能够结合视黄酸受体(RAR)诱导细胞死亡，芬瑞胺对T-ALL细胞株不仅具有急性抗肿瘤作用，而且具有长期抗肿瘤作用。芬瑞替尼抑制CCRF-CEM白血病细胞DES活性呈剂量和时间依赖性，会导致细胞内源性dhCer含量增加。

肺泡横纹肌肉瘤(aRMS)：一种高度恶性的儿童恶性肿瘤，其特征是特异的染色体易位，主要编码致癌转录因子PAX3-FOXO1，因此也被称为融合阳性RMS (FP-RMS)。

之前，作者已经发现芬瑞胺(维甲酸对羟基苯胺)可以影响PAX3、FOXO1表达水平和FP-RMS细胞活力。但芬瑞胺的作用模式还没有更多的研究。接下来文章就从芬瑞胺的作用模式入手，对芬瑞胺诱导细胞死亡的形式展开了研究。

本文得出了以下几点结论：

1.芬瑞胺参与了一种新的细胞死亡形式，这是传统化疗药物无法利用的，这一事实使它成为治疗FP-RMS患者的一个有前途的组合伙伴。潜在的联合治疗药物可能是诱导典型的细胞凋亡或坏死性死亡，甚至是其他形式的细胞死亡，如自噬或铁死亡等。

2.芬瑞胺诱导的线粒体活性氧干扰了动力依赖性大细胞增多症的调节，导致细胞细胞质中的小泡积聚，这与FP-RMS细胞的强细胞毒性作用有关。

3.因为芬瑞胺已经在儿童临床使用，并且在短期和长期治疗方案中只有中度副作用，研究结果可能会刺激芬瑞胺在未来的临床应用扩展到FP-RMS治疗。

几个背景介绍：

芬瑞胺：一种合成的类维生素A衍生物，能够结合视黄酸受体(RAR)诱导细胞死亡，芬瑞胺对T-ALL细胞株不仅具有急性抗肿瘤作用，而且具有长期抗肿瘤作用。芬瑞替尼抑制CCRF-CEM白血病细胞DES活性呈剂量和时间依赖性，会导致细胞内源性dhCer含量增加。

肺泡横纹肌肉瘤(aRMS)：一种高度恶性的儿童恶性肿瘤，其特征是特异的染色体易位，主要编码致癌转录因子PAX3-FOXO1，因此也被称为融合阳性RMS (FP-RMS)。

之前，作者已经发现芬瑞胺(维甲酸对羟基苯胺)可以影响PAX3、FOXO1表达水平和FP-RMS细胞活力。但芬瑞胺的作用模式还没有更多的研究。接下来文章就从芬瑞胺的作用模式入手，对芬瑞胺诱导细胞死亡的形式展开了研究。

本文得出了以下几点结论：

1.芬瑞胺参与了一种新的细胞死亡形式，这是传统化疗药物无法利用的，这一事实使它成为治疗FP-RMS患者的一个有前途的组合伙伴。潜在的联合治疗药物可能是诱导典型的细胞凋亡或坏死性死亡，甚至是其他形式的细胞死亡，如自噬或铁死亡等。

2.芬瑞胺诱导的线粒体活性氧干扰了动力依赖性大细胞增多症的调节，导致细胞细胞质中的小泡积聚，这与FP-RMS细胞的强细胞毒性作用有关。

3.因为芬瑞胺已经在儿童临床使用，并且在短期和长期治疗方案中只有中度副作用，研究结果可能会刺激芬瑞胺在未来的临床应用扩展到FP-RMS治疗。

几个背景介绍：

芬瑞胺：一种合成的类维生素A衍生物，能够结合视黄酸受体(RAR)诱导细胞死亡，芬瑞胺对T-ALL细胞株不仅具有急性抗肿瘤作用，而且具有长期抗肿瘤作用。芬瑞替尼抑制CCRF-CEM白血病细胞DES活性呈剂量和时间依赖性，会导致细胞内源性dhCer含量增加。

肺泡横纹肌肉瘤(aRMS)：一种高度恶性的儿童恶性肿瘤，其特征是特异的染色体易位，主要编码致癌转录因子PAX3-FOXO1，因此也被称为融合阳性RMS (FP-RMS)。

之前，作者已经发现芬瑞胺(维甲酸对羟基苯胺)可以影响PAX3、FOXO1表达水平和FP-RMS细胞活力。但芬瑞胺的作用模式还没有更多的研究。接下来文章就从芬瑞胺的作用模式入手，对芬瑞胺诱导细胞死亡的形式展开了研究。

本文得出了以下几点结论：

1.芬瑞胺参与了一种新的细胞死亡形式，这是传统化疗药物无法利用的，这一事实使它成为治疗FP-RMS患者的一个有前途的组合伙伴。潜在的联合治疗药物可能是诱导典型的细胞凋亡或坏死性死亡，甚至是其他形式的细胞死亡，如自噬或铁死亡等。

2.芬瑞胺诱导的线粒体活性氧干扰了动力依赖性大细胞增多症的调节，导致细胞细胞质中的小泡积聚，这与FP-RMS细胞的强细胞毒性作用有关。

3.因为芬瑞胺已经在儿童临床使用，并且在短期和长期治疗方案中只有中度副作用，研究结果可能会刺激芬瑞胺在未来的临床应用扩展到FP-RMS治疗。

几个背景介绍：

芬瑞胺：一种合成的类维生素A衍生物，能够结合视黄酸受体(RAR)诱导细胞死亡，芬瑞胺对T-ALL细胞株不仅具有急性抗肿瘤作用，而且具有长期抗肿瘤作用。芬瑞替尼抑制CCRF-CEM白血病细胞DES活性呈剂量和时间依赖性，会导致细胞内源性dhCer含量增加。

肺泡横纹肌肉瘤(aRMS)：一种高度恶性的儿童恶性肿瘤，其特征是特异的染色体易位，主要编码致癌转录因子PAX3-FOXO1，因此也被称为融合阳性RMS (FP-RMS)。

之前，作者已经发现芬瑞胺(维甲酸对羟基苯胺)可以影响PAX3、FOXO1表达水平和FP-RMS细胞活力。但芬瑞胺的作用模式还没有更多的研究。接下来文章就从芬瑞胺的作用模式入手，对芬瑞胺诱导细胞死亡的形式展开了研究。

本文得出了以下几点结论：

1.芬瑞胺参与了一种新的细胞死亡形式，这是传统化疗药物无法利用的，这一事实使它成为治疗FP-RMS患者的一个有前途的组合伙伴。潜在的联合治疗药物可能是诱导典型的细胞凋亡或坏死性死亡，甚至是其他形式的细胞死亡，如自噬或铁死亡等。

2.芬瑞胺诱导的线粒体活性氧干扰了动力依赖性大细胞增多症的调节，导致细胞细胞质中的小泡积聚，这与FP-RMS细胞的强细胞毒性作用有关。

3.因为芬瑞胺已经在儿童临床使用，并且在短期和长期治疗方案中只有中度副作用，研究结果可能会刺激芬瑞胺在未来的临床应用扩展到FP-RMS治疗。

几个背景介绍：

芬瑞胺：一种合成的类维生素A衍生物，能够结合视黄酸受体(RAR)诱导细胞死亡，芬瑞胺对T-ALL细胞株不仅具有急性抗肿瘤作用，而且具有长期抗肿瘤作用。芬瑞替尼抑制CCRF-CEM白血病细胞DES活性呈剂量和时间依赖性，会导致细胞内源性dhCer含量增加。

肺泡横纹肌肉瘤(aRMS)：一种高度恶性的儿童恶性肿瘤，其特征是特异的染色体易位，主要编码致癌转录因子PAX3-FOXO1，因此也被称为融合阳性RMS (FP-RMS)。

之前，作者已经发现芬瑞胺(维甲酸对羟基苯胺)可以影响PAX3、FOXO1表达水平和FP-RMS细胞活力。但芬瑞胺的作用模式还没有更多的研究。接下来文章就从芬瑞胺的作用模式入手，对芬瑞胺诱导细胞死亡的形式展开了研究。

本文得出了以下几点结论：

1.芬瑞胺参与了一种新的细胞死亡形式，这是传统化疗药物无法利用的，这一事实使它成为治疗FP-RMS患者的一个有前途的组合伙伴。潜在的联合治疗药物可能是诱导典型的细胞凋亡或坏死性死亡，甚至是其他形式的细胞死亡，如自噬或铁死亡等。

2.芬瑞胺诱导的线粒体活性氧干扰了动力依赖性大细胞增多症的调节，导致细胞细胞质中的小泡积聚，这与FP-RMS细胞的强细胞毒性作用有关。

3.因为芬瑞胺已经在儿童临床使用，并且在短期和长期治疗方案中只有中度副作用，研究结果可能会刺激芬瑞胺在未来的临床应用扩展到FP-RMS治疗。

几个背景介绍：

芬瑞胺：一种合成的类维生素A衍生物，能够结合视黄酸受体(RAR)诱导细胞死亡，芬瑞胺对T-ALL细胞株不仅具有急性抗肿瘤作用，而且具有长期抗肿瘤作用。芬瑞替尼抑制CCRF-CEM白血病细胞DES活性呈剂量和时间依赖性，会导致细胞内源性dhCer含量增加。

肺泡横纹肌肉瘤(aRMS)：一种高度恶性的儿童恶性肿瘤，其特征是特异的染色体易位，主要编码致癌转录因子PAX3-FOXO1，因此也被称为融合阳性RMS (FP-RMS)。

之前，作者已经发现芬瑞胺(维甲酸对羟基苯胺)可以影响PAX3、FOXO1表达水平和FP-RMS细胞活力。但芬瑞胺的作用模式还没有更多的研究。接下来文章就从芬瑞胺的作用模式入手，对芬瑞胺诱导细胞死亡的形式展开了研究。