Transwell实验介绍由普拉特泽生物品台总结分享，细胞检测平台为广大科研实验人员提Transwell外包实验服务，先一起来学习学习Transwell检测实验报告

一、实验原理

侵袭是Transwell实验的一种，可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，小室底部铺了一层聚碳酸酯膜相隔。聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。通过结晶紫然后后测定细胞计数值可反映肿瘤细胞的侵袭能力。

二、实验通用仪器及试剂

   1.主要仪器

2. 主要试剂

三、实验步骤

1. 细胞复苏

(1)     将ddH₂O预温至37℃。

(2)     戴上手套和口罩帽子，从液氮罐中取出装有目的细胞的冻存管（内有1 mL细胞混合液），立即投入37℃ ddH2O中，轻摇冻存管使之在1分钟内快速溶解。

(3)     完全溶解后，75%酒精擦拭冻存管外壁消毒后带进超净台。

(4)     在超净台中，在15 mL灭菌离心管中预先加入10 mL新鲜配制的培养基，打开冻存管，将所有冻融的细胞悬液加入该离心管中，常温1000 rpm离心3分钟，吸除上层的培养液。

(5)     1mL培养基重悬细胞沉淀，轻轻吹打混匀后加入T25细胞培养瓶中，补足培养基至5 mL，置于37℃、5% CO2培养箱培养。

(6)     48小时后换液，细胞融合接近80%时即可传代。

2. 细胞预处理

MDA-MB-231细胞用含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基，在37 ℃饱和湿度、含5% CO₂培养箱中培养。

3.细胞转染

(1)     铺板：处于对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化成单细胞悬液，按实验需要接种于6cm皿中，根据细胞大小和形状调整接板细胞量。

(2)     培养：37℃、5% CO₂培养箱中培养过夜，待细胞长至50%~60%汇合度进行转染。

(3)     质粒和脂质体准备：用500 μL的不含血清的培养基孵育8µg的质粒；500 μL的不含血清的培养基孵育16μL的 Lipo3000，静置5 min；将含质粒和含有脂质体的培养基混合，混匀后室温静置20 min。

(4)     弃去板中原有培养基，加入无血清培养基，加入混合液，4-6 h后换含血清的培养基培养48 h。

4.侵袭实验

(1)     用无血清培养基稀释Matrigel基质胶，小室室各加100 μL（20-30 μg/孔），放入37℃培养箱中待其凝固，出现“白色层”取出小室。

(2)     转染48 h后分别消化收集各组细胞，用无血清培养基重悬细胞。

(3)     取出小室，加入500 μL无血清培养基，放入37℃培养箱中。

(4)     吸掉已充分浸润基底膜后的侵袭小室内的培养基。

(5)     加500 μL的含有10% FBS的培养基至下室（侵袭小室外，24孔板孔内）；加300 μL已调节好细胞密度的细胞悬液（5×10⁴个）至侵袭小室内；置于37℃、5% CO₂细胞培养箱48 h。

(6)     取出小室，用4%多聚甲醛固定20 min，用棉签轻柔擦拭以去除侵袭小室内未侵过基底层膜的细胞，以及基底层（Matrixgel），小心操作以免刺穿底层聚碳酸酯膜。

(7)     在新的24孔板孔中加500 μL结晶紫，分别将侵袭小室浸入染色10 min。

(8)     用PBS冲洗掉侵袭小室上多余的染料，置于空气中干燥。

(9)     100倍显微镜拍照，再用PS进行细胞计数，计算各孔的穿过去的细胞数量。

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