大家好，今天普拉特泽生物技术来回答一下大家关于RNA pull-down实验的各种疑难问题。RNA pull-down是研究蛋白互作的核心技术，也是普拉特泽生物分子检测平台的常规实验手段，为广大科研人员提供RNA pull-down实验外包与技术咨询服务，本文就来分享RNA pull-down大家提过的各种问题，记好小本本哦！

        1、RNA pull-down的实验如何防止RNA降解？

        RNA pull-down实验的一大难点就是RNA本身易降解，所以过程中要禁止RNase，以防止降解。因此在整个实验过程中除了EP管、枪头、镊子这些常用的器具需要灭菌，所有试剂均需要DEPC·H2O配置并灭菌！处理后的耗材需要尽快用掉，超过两周则需要重新处理。操作台需要用RNaseZAP擦净，以去除环境中的RNA酶的影响。

        2、RNA pull-down的实验如何防止RNA降解？

        实验中RNA与蛋白结合的亲和力低怎么解决？

        首先确定是不是①缓冲环境有没有优化、②裂解完不完全、③磁珠用量、④RNA探针用量这几个方面有问题，依次排除，如果都没有问题，就要考虑是不是RNA连接生物素的效率低的问题，如果是，那么：

        (1)可能是RNA纯度不够，需要重新纯化

        (2)RNA没有变性完全

        (3)连接的时间短，建议连接时间不要少于4小时，必要时可以16℃过夜。

        3、RNA pull-down后银染，条带背景深是什么原因？

        考虑是不是SDS-PAGE染色时间过长或者抗体的质量问题，多克隆抗体经常会出现这种情况，最有可能的情况是样品中包含的非特异性蛋白太多了，针对这一点，有以下解决措施：

        (1)优化孵育时间、温度、盐浓度等条件

        (2)优化缓冲体系，使用严谨性高的缓冲体系

        (3)提高裂解液的质量

        电泳后看不到蛋白条带是不是就代表RNA与蛋白不互作？

        也有可能是体外转录的RNA序列有问题；样品中蛋白质浓度过低同样难以观测到条带，当然还会存在实验操作失误的问题。

        4、RNA pull-down实验前富集LncRNA都有哪些方法？

        富集LncRNA问题其实也就是LncRNA如何被链霉亲和素识别以及如何带上生物素标记的问题，大致上有三种方法:

        (1)探针法:

        针对该LncRNA的序列，设计生物素标记的探针。此种方法最关键的是探针的特异性，所以最好用Northern Blot检测探针的特异性。 可以结合内源的LncRNA是探针法的最大优势。缺点就是比较贵，需要的样品量大。

        (2)生物素标记法:

        在LncRNA的5‘端加上T7启动子，利用体外转录试剂盒，可以制备大量的LncRNA。再通过生物素标记试剂盒，就能得到大量的生物素标记的LncRNA。常用的折叠的方法退火，从95℃退火到4℃，大约30秒一度就可以了。

        (3)TRSA法:

        除了生物素，链霉亲和素还可以识别TRSA结构，因此在LncRNA的一端加上TRSA序列也是不错的选择。

        5、RNA pull-down的实验有对照吗？

        有，探针法和生物素标记法的对照都是相应的反义序列：探针的反义序列以及长非编码RNA的反义序列。TRSA法的对照是TRSA序列本身。

        关于RNA pull-down实验的问题我们就讲到这里啦，如果您还有关于RNA pull-down实验的技术问题欢迎随时联系我们，如果您有RNA pull-down实验外包的需求欢迎联系普拉特泽~