第一章：RNA干扰技术是什么？

在基因功能研究过程中，我们常常会用到基因干扰技术。尽管大部分人可能听说过RNA干扰技术，但是对它的了解可能还停留在找生物公司合成序列进行实验（交给生物公司一段序列，然后生物公司合成，寄回合成的干扰RNA，再按照师兄师姐祖传下来的实验操作步骤像个无情的机器人一样一步步操作，然后就会发现：怎么这个东西对我的基因毫无干扰效果啊，然后开始去找生物公司麻烦，要求退款），对这项技术背后的奥秘却往往一知半解，更有甚者一无所知。但其实这项技术不仅揭示了生命体内基因表达调控的复杂性，更为疾病治疗、基因编辑等领域带来了革命性的突破，绝对不仅仅是咱们下个单合成后按照步骤操作那么简单。那本期文章将带大家深入了解RNA干扰技术的起源、发展历程、作用机制以及广泛的应用领域，希望能给刚接触RNA干扰技术的小伙伴们提供一些，除蒙着头做实验外的一些答疑解惑，同时，也为科研工作者提供一些有价值的参考与启示

在之前学习中，我们学习了基因表达，如果我们将基因表达比喻为河流中的水流，而基因干扰技术则如同河流中的调控闸门。在正常情况下，基因按照其内在的逻辑和节奏进行表达，犹如河流中的水流按照地势和气候的自然规律流淌。然而，当我们需要在某些特定情境下调节或阻断某些基因的表达时，基因干扰技术便如同调控闸门一样发挥作用。这个调控闸门通过接收特定的指令（如RNA干扰技术中的小分子RNA，如siRNA、shRNA或者miRNA），能够精确地识别并锁定特定的mRNA分子。一旦这些mRNA分子被锁定，它们就会被引导至降解途径，相当于水流被闸门截断。这样一来，特定的基因表达就被“闸门”阻挡，实现了对该基因活动的抑制或完全阻断，从而达到我们期望的调控效果。

  第二章：RNA干扰现象-生命的自我保护与进化之谜

了解完之后相信大家对于RNA干扰的机制还处于一知半解的状态，别着急，接下来我们带大家一起来学习并参透其中的奥秘。

RNA干扰现象是一种古老而普遍的生命现象。早在1988年代初，科学家们就开始注意到：双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象，而后在植物和真菌中相继发现双链RNA抑制基因表达的现象，科学家们将其命名为RNA干扰。（。之后他们发现从单细胞生物到复杂的动植物（如秀丽新小杆线虫、真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼以及人类等真核生物），无一不存在RNA干扰的现象，通过这些结果，科学家们已经认识到，这绝不是小部分的偶然事件，而是生命体中的，一种普遍存在的基因表达调控机制。因此科学家们开始思考，为什么生物体会进化出RNA干扰这样的机制呢？这背后究竟隐藏着怎样的生命奥秘呢？

首先，我们需要从细胞的生活环境说起。细胞作为生命的基本单位，在漫长的进化历程中面临着来自病毒、细菌等外来病原体的不断侵扰。当第一个被病毒RNA侵扰的细胞出现时，这个幸运的细胞可能恰好拥有一条与病毒RNA互补配对的序列，这条序列就像一把精准的钥匙，能够识别并结合病毒RNA，启动降解过程，将其转化为无害的碎片。这种偶然但关键的互补配对，为细胞提供了一种自我保护机制，即RNA干扰。而有些倒霉蛋细胞，它们没有这条“幸运”序列，因此无法有效抵御病毒的入侵，从而更容易被病毒消灭，这也是达尔文自然选择、适者生存法则在微观世界的体现。随着时间的推移，越来越多的细胞发觉要想不做倒霉蛋，不被病毒RNA消灭，就必须要进化出这种RNA干扰机制。它们不仅能够识别并降解病毒RNA，还能够调节自身基因的表达，从而适应不同的环境变化。

在siRNA和shRNA还未发现之前，RNA干扰的主角是天然存在于生物体内的miRNA。前体miRNA经过一系列的加工过程最后得到了成熟的miRNA，随后成熟的miRNA再和特定的蛋白质（RISL蛋白）形成了一个RNA诱导的沉默复合体RISC。RISC在细胞质中巡逻，寻找着与其携带的miRNA互补的mRNA。一旦一个靶mRNA与miRNA形成碱基配对，该mRNA就会瞬间被存在于RISC中的核酸酶降解掉，一旦RISC解决好了一个mRNA分子后，RISC便得到了解放，就可以着手于再去寻找新的mRNA分子，由此高效的阻断mRNA编码的蛋白质的产量，根据配对程度的不同，靶mRNA要么在RISC中被核酸酶降解，要么就被转移到细胞质中被其他的细胞核酸酶所摧毁。

如何来理解这个过程呢？我们可以把RISC复合体看做城市里的特工队：RISC特工队在细胞质这个繁忙的城市中巡逻，他们的任务是搜寻那些与miRNA“密码”相匹配的mRNA“嫌疑犯”。每当RISC发现一个可以与miRNA配对的mRNA目标时，队伍中的“核酸酶特工”会立即采取行动。根据“嫌疑犯”的“罪行”轻重（即配对程度的不同），RISC有两种处理方式：一种是直接在现场（RISC内部）用核酸酶将其“逮捕并销毁”；另一种则是将其“移送”到细胞质的其他区域，由其他“细胞核酸酶警察”进行进一步的处理和摧毁。一旦RISC成功处理完一个mRNA分子，他们就如同完成了一次任务，重新整装待发，继续在城市中巡逻，寻找下一个目标。这样的工作方式让RISC能够高效地阻止mRNA所编码的蛋白质“罪犯”的产生，从而维护细胞内的基因秩序和安全。

  第三章：miRNA：诺贝尔生理学奖背后的秘密

在RNA干扰包括许多的小分子RNA如miRNA、siRNA和shRNA，其中miRNA（微小RNA）无疑是最耀眼引人注目的一类。在今年的10月7日，诺贝尔生理学或医学奖颁发给了美国的两位科学家（Victor Ambros和Gary Ruvkun），他们因发现microRNA及其在转录后基因调控中的作用而共同获得这一奖项，这一事件更是将miRNA的研究推向了新的热潮。那么，miRNA究竟是什么呢？

miRNA是一类长度约为20-25个核苷酸的非编码内源性RNA分子。它们广泛存在于生物体内，通过调节基因的表达来参与多种生物过程。尽管大家可能只知道miRNA能够与靶基因的3’UTR区配对并降解mRNA，但miRNA的功能远不止于此。事实上，miRNA具有多种功能，包括阻止翻译过程、降低RNA的稳定性以及在某些情况下激活翻译等。

阻止翻译过程：当miRNA与靶mRNA的3’UTR部分互补配对时，它们会形成一个双链结构。这个结构会阻止核糖体与mRNA的结合，从而抑制翻译过程的起始。即使核糖体已经与mRNA结合，miRNA也可以干扰tRNA对密码子的识别，导致翻译过程的提前终止。

降低RNA的稳定性：除了抑制翻译，miRNA还可以通过诱导靶mRNA的降解来降低其稳定性。这通常发生在miRNA与靶mRNA的序列部分互补但并非完全互补的情况下。通过结合特定的酶（如Dicer酶和RISC复合体），miRNA可以引导这些酶对靶mRNA进行切割，从而使其降解。

在某些情况下激活翻译：近期的研究发现，miRNA并非总是抑制翻译。在某些情况下，它们也可以激活翻译。这通常发生在细胞核内，通过结合增强子来激活基因表达，这种miRNA被称为NamiRNA（nuclear activating miRNA）。然而，这种激活作用的具体机制尚不完全清楚，需要进一步的研究来揭示。

一般来说，这些不同功能的实现，取决于miRNA与靶基因之间的，互补配对的碱基数目的多少即配对的程度。当miRNA与靶mRNA的3’UTR区部分互补时，它们就会形成双链结构并抑制翻译过程；而当miRNA与靶mRNA的序列完全互补时，它们就会直接降解靶mRNA。也就是说互补配对的碱基越多，基因干扰的效果就越好。

然而，我们在实验过程中会发现一个有趣的现象是：当我们在细胞中过表达miRNA后，其QCR（定量反转录PCR）结果不显著，但是蛋白水平却显著下降呢？这主要是因为miRNA的作用机制是在转录后水平上进行调节的。即使mRNA的转录水平没有显著变化，miRNA仍然可以通过抑制翻译过程或降解mRNA来降低蛋白的表达水平。

由于miRNA与靶mRNA之间的碱基配对不需要完全互补，因此它们可以识别并调节多个靶基因的表达，也就是说一个miRNA可以对应多个mRNA序列进行干扰和调节。同时，miRNA作为内源性RNA分子，在细胞内的存在和作用更加复杂且微妙，它们可以通过与靶mRNA的结合来影响其稳定性、翻译效率以及与其他分子的相互作用等。

  第四章：siRNA与shRNA-人造基因干扰武器

科学家在解析了miRNA的作用机制后开始意识到，由于靶点众多，miRNA的靶向性相对而言可能不够精确，有时难以准确而有效地阻断特定基因的表达。这种靶向性的不足，在一定程度上限制了miRNA在基因调控领域的应用范围和效率。

因此科学家们发明了siRNA（小干扰RNA）这一人造的RNA干扰工具。siRNA是一种长度为21-23个核苷酸的双链RNA分子。它们通常通过化学合成或体外转录等方法获得，并可以与特定的靶mRNA序列完全互补配对。其作用机制与miRNA相似：当双链siRNA进入细胞后，它们会被RISC复合体识别并切割成单链形式。然后，单链siRNA会与靶mRNA结合并引导RISC复合体对其进行切割或降解。与miRNA不同的是，siRNA是非内源性的RNA分子而是人为设计合成的，我们可以对其序列、结构和活性可以进行精确的控制和调整，因此siRNA通常比miRNA具有更强的精准性和靶向性。

siRNA一般有两种靶向序列：一种是CDS序列（编码序列），另一种是调控区（即非编码区，如启动子、增强子和转录因子等所在的区域）。由于CDS序列与蛋白质的氨基酸序列直接相关，因此针对CDS设计的siRNA能够高度特异性地识别并降解目标mRNA，从而显著抑制靶基因的表达。而靶向调控区的siRNA设计的基因干扰过程通常涉及DNA的甲基化，因此会导致基因沉默而非降解mRNA。同时由于调控区的序列复杂性较高，且不同基因之间的调控机制存在差异，靶向调控区的siRNA可能通过影响基因表达的调控过程来间接调节基因表达水平，但其作用机制和效果可能相对复杂和难以预测。因此在我们设计siRNA时可尽量选择CDS区来进行设计以提高其干扰效果。

然而，siRNA的发展也面临着一些挑战。由于siRNA是非内源性的RNA分子，它们在细胞内的稳定性和持久性相对较差。同时，siRNA的转染效率和靶向性也受到多种因素的影响，如细胞类型、转染方法、siRNA序列设计等。这些因素限制了siRNA在基因治疗等领域的应用。

为了克服这些挑战，科学家们在siRNA的基础上发明了shRNA。shRNA是一种具有特殊结构的RNA分子，它们可以形成一个短发夹结构并包含两个互补的序列，且通过载体病毒等介质进入细胞。当shRNA进入细胞后，它们会被细胞内的酶识别并切割成两个单链形式的siRNA分子。然后，这两个siRNA分子会分别靶向并降解不同的靶mRNA序列。

shRNA的出现解决了siRNA瞬时效应的问题。由于shRNA可以在细胞内持续产生siRNA分子，因此它们可以实现持续稳定的基因干扰效果。这种特性使得shRNA在基因治疗、疾病模型构建等领域具有更广泛的应用前景。

此外，还有一个有趣的问题值得探讨：能否用RNA干扰技术干扰掉RNA干扰现象呢？这个问题看起来似乎有些抽象和自相矛盾，但其实目前市面上售卖的许多miRNA的抑制剂可以不就可以完美解决这个问题吗？这些抑制剂通过与miRNA结合来阻止其与靶mRNA的配对和切割过程，从而抑制RNA干扰现象。同样地，我们也可以设计针对siRNA或shRNA的抑制剂来干扰它们的作用效果。这种策略为RNA干扰技术的调控和应用提供了新的思路和方法。

        第五章：三类小分子RNA的异同

在了解了RNA干扰技术的起源、发展历程以及miRNA、siRNA和shRNA的具体作用机制后，接下来我们对这三类小分子RNA进行一个总结，分析下他们的异同。

1. 差异：

①　来源与性质：miRNA是内源性的RNA分子，而siRNA和shRNA则是人造的非内源性RNA分子。

②　持久性与稳定性：由于miRNA是内源性的，它们在细胞内的存在和作用更加稳定且持久；而siRNA则存在瞬时效应的问题，需要频繁转染才能维持干扰效果（这也是为什么通常我们会发现siRNA在转染后72-96h干扰效果非常不好的原因）；shRNA则通过持续产生siRNA分子来解决这一问题。

③　靶向性：siRNA和shRNA具有更强的精准性和靶向性，可以针对特定的靶mRNA序列进行干扰，一对一；而miRNA的靶点通常非常多，一个miRNA可以对应多个mRNA序列进行干扰和调节，一对多。

2. 相似之处：

①　作用效果：无论是miRNA、siRNA还是shRNA，它们都属于基因沉默的范畴。它们都是通过特定的RNA分子与靶mRNA序列进行配对和切割来实现基因表达的抑制或调节。

②　原理与结构：这三类RNA都遵循着相似的原理和结构特点。它们都通过碱基配对来识别并切割靶RNA分子；同时，它们都具有特定的序列和结构特征来确保其功能的实现。

总的来说，RNA干扰技术作为技能功能研究领域的一项革命性突破，为我们提供了强大的工具和方法来研究和调控基因表达。通过深入了解miRNA、siRNA和shRNA等RNA分子的作用机制和特点，我们可以更好地利用这些工具来探索生命的奥秘并为疾病治疗、基因编辑等领域带来新的希望和突破。本期内容就讲到这里，想看视频版本的可以直接点击【RNA干扰：你真的了解它的奥妙吗？】

希望能对大家有所启示！谢谢大家。

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