中国学者俨然已经对“套路式研究”充满排斥。

  从热点追逐，到形成套路，再跟风灌水，最后疲倦嘲讽，仿佛是中国学者陷入的研究怪圈。

  于是，三五年miRNA、三五年lnc、circRNA，到现在的m6A、外泌体、焦亡、铁死亡...

  我们需要它，利用它，又嫌弃它。

  要知道，科研本没什么热点冷点，最终都是大道相通，科研拥有着最底层的通用逻辑，即高层次的思维模型。

  今天，小编就来带大家看一篇 old fashion的miRNA与靶基因的经典文献，该文发表于Journal of Hepatology杂志，影响因子18.94。

主要讲的是，miR-221-3p结合Gnai基因3’UTR区调节HSCs细胞活化影响肝纤维化。

乍一看，很多人都觉得：套路，老套路！

恩，小编一开始也是这么觉得的，但是，本文最大的研究亮点在它的fig1，即如何发现并获得了影响肝纤维化的miR-221-3p。

按一般的研究套路，大部分的老师会选择临床样本或动物模型样本进行大规模的测序，筛选差异miRNAs。但本文秀就秀在没有按套路出牌，而是将miRNA文库（302个不同的miRNA的mimics）直接与小鼠肝细胞及肝星型细胞进行共孵育，发现有15个miRNAs直接与肝纤维激活有关。然后再用ELISA检测了上清中TIMP1（可调节肝纤维化）的表达水平，最终发现并确定了miR-221-3p。

文章总结

作者通过动物造模、细胞转染、共培养、过表达、干扰载体构建等实验方法，

使用qPCR，原位杂交，WB，HE，天猩红染色，免疫荧光，ELISA等检测技术得到了如下结论。

悄悄告诉大家，这些实验我们都可以做，可随时Call我哦

结论：在慢性肝损伤期间，阻断肝细胞中的miRNA-221-3p功能有助于肝脏的恢复和更快地解决细胞外基质的沉积问题。此外，作者证明，miRNA-221-3p对GNAI2具有转录后调控作用，导致C–C motif趋化因子配体2的分泌减少，从而减轻了肝纤维化。miRNA-221-3p的抑制可作为治疗肝纤维化的治疗方法之一。

Fig 1 通过miRNA文库筛选得到一个潜在的纤维化调节子：miR-221-3p

作者首先用miRNA文库与小鼠肝细胞进行孵育，然后与Col-GFP HSCs细胞（可简单理解为肝纤维化报告细胞）共培养，得到了15个肝纤维化相关的miRNA，之后ELISA检测TIMP1基因（可以调节纤维化）的表达水平，进而获得了潜在的纤维化调节子：miR-221-3p。（A-E）

注释：Col1a1, Acta2, Tgfbr1均为纤维化的标志物。

Fig 2 在肝纤维化过程中，原代肝细胞中的miR-221-3p表达上调

原位杂交和qPCR结果显示，肝纤维化小鼠的肝脏miR-221-3表达量显著高于对照组（A，B）。之后分离纯化肝纤维化小鼠的肝细胞、肝星状细胞、Kupffer 细胞，发现在肝细胞、肝星状细胞中，miR-221-3p的表达量显著高于对照组（正常小鼠）（C）。作者之后构建了TuD-miR-221-3p（AAV -Tud） 以后续进行miR-221-3p的敲降。（D，E证明了构建的TuD-miR-221-3p 是有效的）

注释：PUMA (BBC3编码）已知的miR-221-3p靶向蛋白。

Fig 3 在肝细胞中，miR-221-3p的抑制可减轻肝纤维化

作者进行纤维化小鼠模型构建，并在第6周和第8周注射AAV -Tud，第9周取小鼠组织进行相关实验，qPCR结果显示与Control组相比，AAV -Tud注射组的miR-221-3p 表达量显著降低，WB检测其靶向蛋白PUMA，与Control组相比，PUMA表达量明显上升。由此表明了miR-221-3p功能被抑制（A-C）。之后对组织进行病理染色，与Control组相比，AAV -Tud注射组肝纤维化区域少，且肝损伤以及细胞浸润减少（D，E） ，且血清中的AST、 ALT、bilirubin含量降低（E）。由此表明，miR-221-3p功能抑制可减少肝损伤。

因为纤维化的发展是由HSCs调节的，作者对HSC激活相关的标记蛋白（Col1a1, Acta2, Tgfbr1）进行检测，发现与Control组相比，miR-221-3p的敲降组的肝细胞和肝星状细胞中Col1a1、 Acta2、Tgfbr1表达均下调（F，I）。IF结果显示与Control组相比，miR-221-3p的敲降中a-SMA和结蛋白阳性细胞明显降低（H）。

ɑ-SMA：ɑ平滑肌肌动蛋白， 静止的HSCs通过分化为表达平滑肌肌动蛋白（ɑ-SMA）的成肌纤维细胞而被激活。

Fig 4 在肝纤维化进程中，miR-221-3p参与Gnai2的转录后调控

作者通过生物信息学分析以及相关软件预测，获得miR-221-3p可能的靶向基因Gnai2（有文章表明其在慢性肝病中扮演重要角色）（A）。WB和qPCR结果显示，与健康组相比GNAI2的表达水平较低（B)，与Control相比，AAV Tud组GNAI2表达水平提高（C，D），这可能与miR-221-3p的上调有关。之后用miR-221-3p mimics处理正常肝细胞，结果显示，与阴性对照组相比，miR-221-3p mimics处理组的GNAI2表达水平显著降低（E）。双荧光素酶实验结果进一步证明了miR-221-3p mimics直接靶向Gnai2的3’UTR。综上，作者证明miR-221-3p直接参与Gnai2的转录后调控。

Fig 5 肝细胞中，miR-221-3p的抑制通过GNAI2抑制了HSCs的激活

为了探讨肝细胞中Gnai2的调节是否激活HSCs，作者用Gnai2基因过表达载体处理肝细胞（Gnai2 ovx组），处理一段时间后与HSCs细胞共培养，之后做qPCR和免疫荧光染色，结果显示，与对照组相比，p75NTR、ɑ-SMA、Desmin表达量显著下调。（A，B）

之后作者用miR-221-3p inhibitor以及siGnai2处理肝细胞一段时间后与HSCs细胞共培养，免疫荧光染色结果显示，siGnai2处理抵消了miR-221-3p inhibitor导致的HSCs的激活（C）

。这些结果表明，在肝细胞中，GNAI2有助于减少miR-221-3p抑制时HSC的激活。

备注：p75神经营养素受体(p75NTR)在静止的HSCs中以低水平表达,但在HSCs激活后迅速增加。

Fig 6 在肝细胞中，GNAI2的上调抑制CCL2表达，进而抑制HSC激活并改善肝纤维化

之后作者想要搞清楚通过GNAI2激活HSCs的机制，作者认为CCL2可能是miR-221-3p/

GNAI2信号的关键部分。作者发现在肝细胞中，与Control组相比，AAVTuD组的CCL2 mRNA显著下调，但在非实质细胞中没有这个现象（A，B）。在肝细胞中，Gnai2过表达可以减少CCL2的分泌（C）。ELISA结果显示miR-221-3p抑制引起CCL2的减少（D）。用siGnai2处理，CCL2的分泌量显著增加（E，F）。

为了进一步验证CCL2对HSCs的直接影响，作者用CCL2处理HSCs，之后用QPCR和免疫荧光染色结果显示， Col1a1、Acta2、Tgfbr1 mRNA水平和p75NTR、a-SMA、desmin蛋白质水平显著增高（G，H）。miR-221-3p inhibitor处理后用同样的方法测相同的指标，结果与CCL2处理组相反（I，J）。

以上结果表明，在肝细胞中，miR-221-3p inhibitor导致GNAI2的上调，而GNAI2的上调进而抑制CCL2表达，从而抑制HSC激活并改善肝纤维化。

备注：趋化因子CCL2，一个关键的调节因子炎症和肝纤维化。已据报道，在小鼠Gnai2基因敲除后升高。

Fig 7 DDC模型中，miR-221-3p抑制同样可减少其肝纤维化

作者为了确定miR-221-3p抑制效果是否仅限于CCl4模型，作者构建胆汁淤积性纤维化（DDC）模型，之后做病理染色以及肝纤维化相关指标的mRNA分析，结果与CCl4模型一致（B-F）。由此可知，miR-221-3p抑制同样可减少DDC模型的肝纤维化。

Fig 8 改变miR-221-3p在原代人肝细胞中的表达，抑制原代人肌成纤维细胞纤维化。

为了检测本研究是否适用于人类肝细胞，作者使用miR-221-3p inhibitor处理过的培养基上清处理原发性人类肌成纤维细胞，对Col1a1、Acta2、Tgfbr1进行定量QPCR分析，对p75NTR、a-SMA、desmin、LOX进行免疫荧光染色。结果显示，与Scr组相比，miR-221-3p inhibitor处理组的纤维化相关标记表达水平显著降低（B，C）。这些结果表明，处理miR-221-3p处理组的培养基上清抑制原代人肌成纤维细胞的激活。

最后，作者从纤维化肝脏中分离原代人肝细胞中，检测miR-221-3p的表达是否有改变。qPCR结果显示与对照组相比，miR-221-3p的表达显著提高，GNAI2表达降低，CCL2表达升高（D，E）。