流式检测细胞周期实验的常见问题解答由普拉特泽生物根据承接的几千例流式检测细胞周期实验和各种实验过程中的技术咨询总结而来，普拉特泽生物专注提供线下生物实验研究，积累了大量经验，为广大科研工作者提流式检测细胞周期等各类生物学实验外包。

   前两篇呢，我们讲了用流式检测细胞周期的实验原理、步骤以及操作时的注意事项，链接奉上，忘记的同学请自行回去复习：

流式检测细胞周期实验注意事项

流式检测细胞周期原理及实验步骤分析

   这两篇常见问题集大家咨询的流式和细胞周期检测问题、我们自己操作时总是遇到的问题之大成，拿好笔记本我们准备开始记录吧：

   问题一：在测定细胞周期的时候,由于固定、消化等处理后会出现很多细胞碎片，影响测量结果，无法找到G1期细胞群怎么办？

   回答：在测定细胞周期的时候，除了设置好获取数据的模版外，另外设置直方图，测量模式为对数(log)，调整放大倍数，使二倍体峰出现在横坐标10*3的位置，就很容易的找到了二倍体峰和细胞周期个时相细胞的分布情况。

   问题二：可不可以用70~75%乙醇直接固定细胞，反正乙醇固定细胞的终浓度也是这么多？

   回答：当然不可以，直接用70~75%乙醇加入很容易导致细胞聚团现象，很难重悬成单细胞，影响固定效果，甚至容易导致固定后无细胞沉淀的现象。应该在细胞充分分散成单细胞后，缓慢地滴入无水乙醇中，使其终浓度为70~75%乙醇。

   问题三：细胞量太少，得不到数据结果白做了咋办？

   回答：咱就是说，待测的细胞已经制备完了太少不容易挽救，说一说正确的操作方法吧。

   1）首先，要保证收集足够的细胞样品，普拉特泽技术小姐姐推荐至少需要手机10的6次方左右；如果药物处理后细胞死亡过多，应该降低药物浓度。

   2）然后，固定细胞时先用预冷的PBS重悬细胞，再逐滴滴入无水乙醇中，操作方法请参照上一步。

   3）同时细胞清洗时，不可过度吹打细胞，以防产生过多的细胞碎片。

   4）最后，尽量采用尖底的离心管和水平的离心机，离心后尽量用移液枪吸走上清，不要倾倒，残留一点，不要吸完。

   问题四：做流式分析细胞周期时，收集了10^6左右的细胞，但是固定后没有细胞沉淀，甚至PBS洗涤后上机已经没有细胞了，哪个环节出了问题？

   回答：确定收集了足量细胞但是没有细胞沉淀且上机没看见待测细胞的话，应该洗涤过程中细胞丢失了。应该：

   1）尽量采用尖底的离心管和水平离心机。

   2）离心后尽量用吸管吸取上清，不要倾倒，吸上清时最好残留1 mm左右的水膜，不要吸完。

   3）离心的转速或时间可以适当增加。

   4）每次加试剂时，吸头最好不要接触液面，混匀时最好不要用吸头吹打，以免吸头挂壁带走部分细胞。

   问题五：什么样的结果是正常的？

   回答：请大家抱着结果自己对号入座~

   1）G2/M期细胞的DNA含量是G1期的2倍，在直方图上形成一个2倍于G1信号峰的高斯峰。

   2）CV(变异系数)表示峰的宽度，CV值越小，峰形越好，最好是在5%左右，一般小于10%也被认可。

   3）RCS最好是在1~3，高于5则不被认可。RCS高，说明数据的分布和软件所建立模型的预期值的差别比较大，可能由于处理细胞的时候RNA酶消化不好，或者是PI的浓度不佳造成的。

   问题六：怎样提高实验结果的分辨率和精确度？

   回答：变异系数（Coefficient of Variation，CV值）反映G0/G1峰分辨率和精确度。而样品CV值为样品固有，与样本制备过程中细胞质量有关。细胞碎片越少、细胞聚团越少、RNA酶消化越充分，可以减少样本的CV值，提高G0/G1峰分辨率和精确度。
   好啦，流式检测细胞周期操作过程中我们比较常见的问题就给大家回答到这里,欢迎大家踊跃留言，凑齐八个我们召唤神龙！
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