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彗星电泳实验常见问题与结果分析【附视频教程】

2021-04-26 21:02:33

来源/作者:普拉特泽生物-医学整体课题外包

一、彗星实验的背景与原理

在了解彗星电泳之前,先了解一下DNA损伤的类型,比如单碱基的突变、单碱基的缺失、多碱基的突变、多碱基的缺失以及双链的断裂、碱基的插入、编辑等。

而造成DNA损伤的因素主要有以下几点:ROS活性氧、紫外线、抗肿瘤药物。

彗星1.png


分子水平检测DNA损伤的方法有以下几个:

WB检测γH2AX

qPCR检测DNA损伤表达

彗星电泳:单细胞凝胶电泳

彗星2.png

1984年,OstlingJohanson第一次用中性彗星电泳定量细胞中的DNA损伤;而中性彗星电泳只能检测双链的DNA损伤;后来Singh发展出碱性彗星电泳,它是一种更灵敏的方法,可检测单链、双链的DNA损伤和碱不稳定性位点DNA交联及不完全切除修复位点等多种DNA损伤,适用于检测各种物质的基因毒性。

彗星电泳的实验原理:

电泳过程中,带负电荷的DNA会向正极移动,DNA损伤会产生小的DNA碎片,这些碎片会在琼脂糖凝胶中移动,形成彗星状拖尾,而完整的DNA是因其分子量比较大,无法从细胞核迁移出来。

彗星3.png


二、彗星电泳实验步骤和结果分析

实验步骤

彗星步骤.png

实验步骤有两个关键需要注意一下:

1、实验过程避光;

2、裂解液pH调至10


实验结果与分析

彗星结果.png

阴性对照没有拖尾的形状

而阳性对照组有很明显的拖尾形状

对于拖尾率的计算有专门的计算公式,首先要统计到尾部DNA的含量,即尾部DNA的光强度比上整个细胞的光强度,计算公式详见下图:

彗星分析.png


三、彗星电泳实验的适用范围

主要用于检测基因毒性,例如,检测药物的基因毒性。

优点:灵敏、直观、低成本,需要的细胞数量少,实验周期相对短,可以广泛应用于各种细胞;

缺点:1、易受环境影响,例如紫外、氧化压力;

    2、该实验的通量受限于玻片;

    3、只能简单的反映细胞内碎片化DNA的比例,要全面分析DNA损伤还需要其他实验的佐证。


四、彗星电泳经典案例一览


损伤1.png

损伤2.png

五、彗星实验常见问题及分析

问题1:对照组出现拖尾

原因:样品消化过度或者样品反复冻融


问题2:没有拖尾

原因:细胞裂解不充分


问题3:铺的胶易脱落

原因:胶凝固时间不够


问题4:背景太脏

原因:琼脂糖凝胶,裂解缓冲液和解旋缓冲液都要现配现用。


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彗星电泳实验  视频教程地址(建议微信打开):http://weike.fm/WjiC6156df

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