载体构建是为了把DNA分子运送到受体细胞中去，必须寻找一种能进入细胞、在装载了外来的DNA片段后仍能正常复制的运载体，载体主要有病毒和非病毒两大类，目前理想的运载体是质粒。而在基因工程中，常用的载体是人工改造构建的质粒，载体构建即是构建含外源DNA的质粒。
  那么质粒是什么？它是指存在于细菌、真菌等微生物细胞中、独立于染色体外、能进行自我复制的遗传因子。20世纪80年代质粒被发现，最初发现的质粒均由研究者根据表型、大小等特征自行命名，如F因子（fertility factor，致育因子）、R质粒（resistance factor，抗性质粒）和Col质粒（colicin，大肠杆菌毒素质粒）等。

一个合格质粒的组成要素是什么呢？

1、复制起始位点Ori，即控制复制起始的位点；

2、抗生素抗性基因；

3、多克隆位点 MCS区；

4、P/E  启动子/增强子；

5、Terms 终止信号；

6、poly（A）加尾信号。

不同载体的实验步骤（总括）

关于过表达载体构建与干扰载体构建的实验步骤见下图，
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当实验结果出现无克隆的现象

可能的原因主要是连接不成功或者连接成功，但转化失败。具体原因分别如下：

可能原因一：引物设计不合理；

解决办法： 1、设计原则：同源臂（15-25bp，GC含量40%-60%）+酶切位点（根据实验需求保留或删除）+基因特异性引物；

可能原因二：载体与目的片段重组比例不当；

解决方法： 1、载体和目的片段浓度测定方法：常用吸光度或琼脂糖电泳法；

       2、载体与目的片段添加比例： ①单片段建议：最适载体与目的片段摩尔比为1:2-1:3；

                          ②多片段建议：最适DNA使用量为每片段（含线性化载体）0.03pmol；

可能原因三：载体与目的片段不纯；

解决方法： 1、推荐对线性载体、PCR产物进行胶回收纯化；

       2、纯化产物建议溶解在pH8.0的ddH2O中保存；

       3、若为未纯化的DNA，加入总体积不超过反应体系体积的1/5；

可能原因四：试剂盒失效或者操作问题；

解决方法：建议做试剂盒附带的阳性对照实验，判断方法：

       1、若阳性有克隆并检测为阳性，则排除试剂盒问题；

       2、若阳性对照无克隆，可能是操作问题或试剂盒失效。

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载体构建实验  视频教程地址（建议微信打开）：http://weike.fm/RuJi1a25c

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