做骨稳态研究，总离不开这几个关键词：成骨、成脂、成软骨、增殖、分化、凋亡。成骨及破骨细胞的增殖、分化和凋亡最终决定骨形成及骨吸收，共同构建骨稳态平衡。

今天带大家读一篇机制不复杂，但思路很清晰，逻辑较严密的骨稳态文章。

其实小编一直是很喜欢看骨科相关的研究文章的，没别的原因，就是染色好看！

分享一些小编的骨组织染色案例

文献：

Title：Cytl1通过调节间充质干细胞的成骨和破骨细胞生成来调节小鼠的骨稳态

关键词：Cytl1、间充质干细胞、骨稳态

以前的研究表明，敲除Cytl1（Cytl1-/-）的小鼠表现出正常的软骨内骨化和长骨发育。本文中，作者研究了Cytl1在骨稳态中的潜在功能，发现Cytl1−/− 小鼠的骨量比野生型同窝小鼠高，并且抵抗卵巢切除诱导的骨吸收。

作者研究了Cytl1在骨髓干细胞的成骨和破骨细胞生成中的功能，发现在人间充质干细胞（hMSCs）的成骨过程中，Cytl1被下调。Cytl1能够通过抑制RUNX2从而降低成骨作用，促进未分化hMSCs的增殖，也刺激成骨分化细胞的凋亡。Cytl1−/−敲除小鼠表现出对破骨细胞活性的抑制和巨噬细胞的破骨细胞生成。这些结果共同表明：

1、Cytl1抑制RUNX2从而抑制成骨分化，促进未分化的hMSCs增殖，促进已分化的hMSCs凋亡。

2、Cytl1−/−敲除抑制破骨细胞的生成和活性。

总结：Cytl1负调节hMSCs的成骨分化，并正调节破骨细胞生成及小鼠骨量。

在骨稳态的研究中，尤其是间充质干细胞的三系分化检测中，有几项常见的染色技术罗列如下：

另外还有破骨细胞的TRAP染色，软骨组织的番红固绿染色等。

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正文开始，我们来过一下本文的结果呈现，然后好好学习一下别人是怎么把一个基因的功能坐实的。

作者首先通过检查Cytl1−/− 小鼠和WT同窝小鼠的骨量来检查Cytl1是否调节长骨的体内平衡。与WT同窝小鼠相比，Cytl1−/− 小鼠的骨量增加，骨小梁体积和骨小梁厚度增加，同时伴随小梁分离减少，Cytl1−/− 小鼠的小梁数和每个骨周长的成骨细胞数也显着高于WT同窝小鼠。

这些结果表明，Cytl1功能的丧失会诱导小鼠骨量的增加。为进一步阐明Cytl1在骨稳态中的体内意义，作者检测了小鼠Cytl1敲除是否可以减轻卵巢切除（OVX）诱导的骨吸收。正如预期的那样，卵巢切除的WT小鼠股骨远端的μCT分析显示骨小梁骨丢失，Cytl1-/-缺失组小鼠骨小梁相对正常，但两组之间皮质骨没有显著差异。

接着，为了阐明Cytl1对骨量调节的可能机制，作者将hMSCs分别诱导分化为软骨细胞，脂肪细胞和成骨细胞（也就是我们前文所说的三系分化），QPCR检测Cytl1的mRNA水平。结果显示：在hMSCs的成软骨过程中，Cytl1的表达瞬时增加，但在成脂期间减少，并一直保持在低水平直至分化的晚期。相反，Cytl1表达在早期显着降低成骨的阶段，并且在分化的晚期阶段表现出轻微的恢复。

Cytl1的差异表达模式表明它可能在hMSCs的三系分化期间发挥不同的功能。作者通过用编码人Cytl1（Ad-Cytl1）的腺病毒感染hMSC细胞过表达Cytl1，再次诱导细胞进行三系分化。发现过表达Cytl1不影响软骨形成或脂肪形成。通过成骨诱导培养第18天的茜素红染色确定，Ad-Cytl1的感染剂量依赖性地抑制hMSC的成骨。当进一步检查Cytl1是否调节hMSCs表型转化时，FACS（荧光激活细胞分选）分析结果显示Cytl1的过表达不影响hMSCs标记物：CD29，CD44和CD90的表达。这表明：Cytl1负调节hMSCs的成骨分化，但不影响成软骨或成脂分化。且这一调节作用并不引起hMSCs的表型变化。

接下来作者检查了Cytl1敲低对hMSC成骨的影响。人Cytl1基因特异shRNA慢病毒感染MSCs。通过茜素红染色和培养第18天的矿化定量评估发现，Cytl1的敲低显著促进成骨作用，且敲除Cytl1不影响hMSC标记物CD29，CD44和CD90表达水平。敲低实验进一步支持了之前的结果，即：Cytl1负调节MSCs的成骨作用而不影响其基础MSC表型。

BrdU增殖检测发现，Ad-Cytl1过表达或Cytl1重组蛋白处理的MSCs中增殖能力显著提升，而shRNA介导的Cytl1敲低则抑制增殖。Cytl1上调表达增加了AKT和GSK3β的激活磷酸化从而促进增殖，而用LY294002或Wortmannin处理（AKT特异性抑制剂）MSCs细胞剂量依赖性的消除了AKT对增殖的刺激作用。说明：Cytl1通过AKT信号途径促增值。

与未分化的hMSCs中的这些作用相反，在已经骨生成分化的MSCs中过表达Cytl1（第3天和第7天）并不会影响AKT或GSK3β的磷酸化。然而，MTS检测结果则显示，在已经成骨分化的hMSCs细胞中过表达Cytl1细胞存活率显着降低。在第7天和第14天，由于Cytl1在成骨分化的hMSC中过度表达，TUNEL阳性凋亡细胞的数量显著增加。同时发现，Cytl1的过表达显著增加BAX的蛋白水平而不影响BCL2的蛋白水平。鉴于BAX/BCL2的比例决定了对细胞凋亡的易感性，BAX 蛋白水平的这种增加表明：Cytl1过度表达的成骨分化hMSCs细胞的活力降低，是凋亡增加所引起。此外还发现在成骨分化的hMSCs中Cytl1过表达显著增加p53的蛋白水平，说明是p53在这一过程中上调了凋亡蛋白BAX。

通过AKT抑制（LY294002或Wortmannin）或敲低BAX（特异性siRNA）的手段来评估成骨和Cytl1调节MSCs增殖和凋亡之间的联系。发现AKT抑制不会影响Ad-Cytl1诱导的成骨抑制（茜素红结果），表明AKT信号传导不直接影响hMSCs的成骨，尽管它可通过促进细胞增殖来增加骨祖细胞的数量。相反，BAX的敲低显着阻断了Ad-Cytl1的成骨抑制作用，这清楚地表明Cytl1过表达诱导的BAX上调对于Cytl1调节的MSCs成骨能力是必需的。

在体实验结果表明，与WT同窝小鼠相比，Cytl1−/−基因敲除的小鼠骨小梁中TUNEL阳性凋亡成骨细胞的数量显着减少。所有的结果都表明：Cytl1介导的成骨细胞凋亡调节路径在调节小鼠骨量中的重要作用。最后，作者还证明了Cytl1−/− 小鼠表现出的增加的骨量和对OVX（卵巢切除）诱导的骨吸收的抗性。并发现Cytl1−/− 小鼠中观察到的骨量增加，是由破骨细胞生成减少和MSCs的成骨分化增加所导致。

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