大家好，今天跟普拉特泽生物一起学习的是GST pull down实验的操作步骤。上期咱们简单介绍了一下GST pull down实验，是一个近年来受广大科研人员关注的验证酵母双杂交系统的体外试验技术，普拉特泽生物分子检测平台专业为大家提供GST pull down检测外包服务，提供真实、高质量的实验结果。现在我们来跟着技术来看看GST pull down实验的操作步骤：

        一、GST-a融合蛋白的制备

        1、GST-a融合蛋白的表达

        (1)将目的蛋白与GST的重组质粒转化到BL21菌株中；

        (2)挑取单克隆到含有5mL LB培养基（加入5 μL氨苄）的10 mL试管里，37℃恒温振荡培养箱中培养过夜；

        (3)将培养菌液转移到含有500mL LB（含500 μL氨苄）的1L锥形瓶中，37℃，200 rpm培养数小时；

        (4)测定OD600值，当OD600达到0.6左右时，加入适当浓度的IPTG，在20℃，200rpm条件下培养10-16h（通常需要进行预实验以确定最佳IPTG浓度、诱导温度和时间）；

        (5)诱导适当时间后，将菌液分次倒入50 mL离心管中，4℃ 4000 rpm离心10分钟，然后弃去上清，收集管底菌体，如暂时不用，可将菌体保存于-80℃冰箱中；

        (6)先加入少量PBS于离心管中，离心5-10 min后弃去上清，再按每10 mL菌液沉淀1 mL PBS的量加入相应的PBS，涡旋振荡，使菌体沉淀充分溶解于PBS溶液中；

        (7)把混合菌体置于冰水浴中，用超声仪进行破碎。每次超声破碎20 s，间隔30 s（破碎时间、破碎次数和间隔时间视具体情况而定），经过适当时间超声后，溶液会显得澄清；

        (8)将超声后的溶液4℃ 4000 rpm离心10分钟，上清液转移至新的离心管中，-80℃保存备用。

        2、GST-a融合蛋白的纯化

        (1)在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积50% Glutathione Sepharose 4B，4℃摇床上缓慢摇动30~60 min;

        (2)4℃，4000rpm离心5 min，弃去上清，该Sepharose上结合了GST-a融合蛋白；

        (3)加入200 μL预冷的PBS溶液，轻晃悬浮珠子，将Sepharose洗涤一次，4℃，4000 rpm离心5 min，弃去上清，重复此步骤3次；

        (4)最后一次用移液枪吸走珠子表面的液体，但注意不要吸走珠子，即可获得结合GST-a的Sepharose。

        二、体外蛋白的结合

        1、将结合有GST-a融合蛋白的Sepharose 4B悬浮在适量体积的缓冲液中，加入20 μL含有b蛋白的溶液，同时采用结合有GST蛋白的Sepharose作为阴性对照，在摇床上晃动4-8h（4℃）；

        2、4℃，4000 rpm离心5 min，弃去上清液；

        3、沿壁加入200μL预冷的缓冲液对Sepharose进行洗涤，

        4、4℃，4000rpm离心5 min，弃上清，该步骤重复3次；

        5、吸干Sepharose上面的液体后，加入20ul 1×蛋白电泳上样缓冲液，沸水浴5 min，放入-20℃冰箱备用；

        6、通过SDS-PAGE和Western blot进行检测。

        好啦，那关于GST pulldown实验步骤就分享完啦，如果您也在设计GST pull down实验的话可以留言给我们跟技术一起讨论设计出最好的实验方案哦~如果您觉得实验让您头疼的话也可以把GST pull down实验外包给我们，实验交给我，思考留给您~