GST pull-down实验作为一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术,近年来越来越受到广大学者的青睐。什么是GST呢？GST，全称glutathione-S-transferase，即谷胱甘肽-S-转移酶蛋白，能够和谷胱甘肽（Glutathione，GSH）稳定结合。我们把GSH与琼脂糖交联形成GSH琼脂糖珠，就能够将带有GST标签的诱饵蛋白固定，当体系中存在与诱饵蛋白有直接相互作用的靶标蛋白时，它就能够与微珠固相复合物结合而被“拉”下来，也叫GST pull-down实验。

它的基本原理是将靶蛋白-GST 融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，作为与目的蛋白亲和的支撑物，充当一种“诱饵蛋白”，目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白)，洗脱结合物通过 SDS-PAGE 电泳分离，最后经western blot或质谱分析，从而证实两种蛋白间的相互作用；“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。

实验步骤：

① 获得带有 GST 标签的融合蛋白；

② 将带有 GST 标签的融合蛋白亲和到谷胱甘肽层析柱上；

③ 获取可能与融合蛋白发生相互作用的蛋白；

④ 与融合蛋白发生相互作用的蛋白被亲和到谷胱甘肽层析柱上；

⑤ 切掉标签，洗脱得到相互作用的蛋白。

影响GST pull down实验结果的因素

1、 载体选择

对于不同的实验需要构建的载体是不同的，载体的选择对融合蛋白有很大的影响，需要综合考虑表达融合蛋白的可溶性、能否被 IPTG 诱导表达、以及是否能够高质量表达。目前，经改造的pGEX 载体由于同时具备以上优点而广泛应用于构建 GST 融合蛋白。

2、 诱导温度

不同温度下融合蛋白存在的形式不一，诱导温度的选择对于蛋白的表达也具有较大影响。例如，温度敏感型表达载体需要高温诱导（42ºC），而大部分载体需要低温诱导，因为蛋白间存在较强的温度依赖性疏水作用，温度高时蛋白易聚集形成沉淀，会增加蛋白形成包涵体的几率。从目前研究报道来看，获取可溶性蛋白的最佳诱导温度一般集中在 20～30ºC。

3、 诱导时间

加入诱导物的时机，一般选择在细菌生长的对数期，此时细菌生长速度快，生命活力比较旺盛，此时加入诱导物能获得较多的可溶性融合蛋白。加入诱导物后的诱导时间是根据诱导温度来确定的，一般诱导温度高，诱导表达的时间就较短；温度低，诱导表达的时间就需要适当延长。

4、诱导物浓度

目前广泛应用的诱导 pGEX 系列载体表达的诱导物多为IPTG，该诱导物不会被细菌代谢而保持稳定的浓度，但由于具有一定的细胞毒性，在使用时需要格外注意浓度问题。已有的报道其使用的终浓度从0. 005 mmol/L 到 5 mmol/L不等，但IPTG终浓度过高时，会在短时间内诱导出大量的融合蛋白，导致不正确的折叠以及形成包涵体，不利于获得可溶性蛋白。因此在实验中通常采用低浓度、长时间诱导表达的方式，以获取足够量的可溶性融合蛋白。

5、GST 标签的影响

虽然大多数情况下不会造成影响，但GST标签仍可能会影响蛋白的正确折叠。如果对融合蛋白进行质量控制，会使实验结果更加可信。例如加入核磁共振、X射线晶体分析等方法验证蛋白结构有无变化；通过结合已知互作蛋白验证蛋白功能有无变化等。

6、DNA和RNA的影响

例如，两种并不互作的DNA结合蛋白可能会因为DNA的存在而出现相互作用的假阳性结果，因此，在进行GST pull-down实验时，加入核酸酶的步骤十分必要。