蛋白相互作用在信号通路研究中较为常见，经典的方法有：CO-IP、GST-pulldown、酵母双杂交系统。相较于酵母双杂交、pull down等方法，CO-IP之所以能成为蛋白互作的葵花宝典，是因为--他捕获的蛋白互作发生在所研究的特定组织细胞内，保存了互作蛋白及复合体的“内源”状态。本文就重点教你们练练葵花宝典~

一、注意事项：

（1）细胞裂解采用温和的裂解条件：不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。

（2）使用对照抗体：

单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗

兔多克隆抗体：正常兔IgG

（3）确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；

（4）确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质定位来确定。

（5）要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；

二、常见问题

（1）protein的选择

注：Protein A的载量高

Protein G可以结合更多种属和亚型的抗体，并且结合力更强

二者可以单独使用，也可以混合使用

（2）细胞裂解液的选择？

为了保持目的蛋白本身及其互作蛋白、复合体的天然状态，不遗漏互作蛋白信息，CO-IP样品的蛋白提取应该注意：不使用SDS、Sodium deoxycholate等去离子型去垢剂，不能用尿素、硫脲等强变性剂，也不能经过丙酮/TCA沉淀等导致蛋白变性的有机试剂处理。只能使用如1%的NP40破坏掉细胞膜，获得胞浆蛋白，1%的TritonX-100破坏核膜，获得核蛋白。

尽管CO-IP作为研究蛋白互作经典方法之一，仍有一定的缺点：

（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；

（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者（间接结合）在中间起桥梁作用。

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