非酒精性脂肪肝NAFLD模型常见问题及解决方案由普拉特泽生物技术为大家总结分享。前面我们学习了全面了解非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝（NAFLD）诊断与研究全攻略、揭秘非酒精性脂肪肝动物模型构建以及非酒精性脂肪肝（NASH）小鼠模型关键指标检测指南，可以点击标题直接传送回去学习的哦。普拉特泽生物动物检测平台承接非酒精性脂肪肝模型实验外包上百例，早就为大家把实验过程中要踩的雷、吃的亏帮大家吃完了，现在我们就来看看，实验过程中还有哪些常见的问题和解决方法吧！

前期回顾：

全面了解非酒精性脂肪肝：模型指标与实验设计要点

非酒精性脂肪肝（NAFLD）诊断与研究全攻略：从临床指标到实验方案

揭秘非酒精性脂肪肝动物模型构建（这8个关键指标决定研究成败）

非酒精性脂肪肝（NASH）小鼠模型关键指标检测指南

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)动物模型是研究这一全球高发疾病的重要工具，但在实际建模过程中，研究人员常会遇到各种棘手问题。本文将系统梳理NAFLD动物模型构建中的7大常见问题，并提供经过验证的解决方案，帮助您提高建模成功率，获得可靠研究数据。

一、造模失败：动物未出现预期表型

1. 脂肪变性不明显

●可能原因：

⒈动物品系选择不当（如BALB/c对高脂饮食抵抗）

⒉饲料储存不当导致脂质氧化失效

⒊造模时间不足（高脂饮食需至少12周）

●解决方案：

→选用敏感品系（推荐C57BL/6雄性）

→饲料-20℃保存，开封后2周内用完

→延长造模至16-24周，或改用MCD饮食

2. 炎症反应缺失

常见问题：

▲HFD模型仅产生脂肪变性无炎症

▲炎症评分(NAS)低于3分

改进措施：

▲添加1%胆固醇至HFD

▲改用HFHFrHC（高脂高果糖高胆固醇）饮食

▲结合低剂量CCL4（0.2ml/kg，每周2次）

二、模型不稳定的5大因素及对策

1. 动物个体差异大

表现：同组动物肝脏TG含量差异>30%

控制方法：

严格统一周龄（±3天）

●单笼饲养避免饮食量差异

●预筛选基础代谢指标

2. 季节性波动

●影响：冬季建模效率降低20-30%

●应对：

维持恒定温湿度（22±1℃，50-60%）

固定光照周期（12h/12h）

避免频繁更换饲料批次

3. 操作不规范

典型错误：

●非禁食状态取材

●肝脏取样部位不统一

标准化流程：

●统一禁食6小时后取材

●固定取肝左叶相同位置

●多人操作时进行技术校准

三、病理评估中的3大陷阱

1. 评分主观性

问题：不同病理学家NAS评分差异达2分

解决方案：

▲采用数字化病理分析系统

▲建立实验室内部标准图谱

▲至少2人双盲独立评分

2. 染色质量不稳定

常见问题：

天狼星红染色对比度差

油红O染色背景深

优化方案：

天狼星红：调节pH至2.0-2.5

油红O：使用新鲜配制异丙醇溶液

增设阳性和阴性对照

3. 纤维化评估不足

误区：仅依赖H&E染色判断

全面评估：

天狼星红偏振光观察Ⅰ/Ⅲ型胶原

羟脯氨酸定量检测

α-SMA免疫组化标记活化的HSCs

四、分子机制研究的4大挑战

1. RNA降解

预防措施：

离体后5分钟内投入液氮

使用RNAlater保存

避免反复冻融（分装保存）

2. 蛋白提取困难

脂肪肝特殊处理：

▲增加裂解液体积（1:20组织重量比）

▲超声破碎前用滤纸吸除表面脂质

▲添加蛋白酶抑制剂混合物

3. 数据变异大

改进方法：

▲设内参基因/蛋白（推荐β-actin+GAPDH）

▲每个样本3次技术重复

▲使用qPCR数据分析软件（如qBase+）

4. 通路验证不足

全面策略：

▲关键蛋白Western blot验证

▲免疫荧光共定位分析

▲功能性挽救实验（激动剂/抑制剂）

五、特殊模型构建的3个难点

1. NASH向纤维化进展

加速方案：

→HFHFrHC饮食+0.35mg/kg CCL4（每周1次）

→DIAMOND小鼠模型（24周自发纤维化）

→高脂饮食结合STZ（糖尿病相关纤维化）

2. 性别差异处理

注意事项：

①雌性需去卵巢消除雌激素干扰

②雄性更易造模（优先选择）

③如需雌性模型，需延长造模时间30%

3. 老龄动物模型

特殊处理：

①使用12月龄以上小鼠

②降低饮食脂肪含量（从60%降至45%）

③密切监测生存率（可能需提前取材）

六、数据发表的5个必备验证

1. 代谢表型验证

必测指标：

口服糖耐量(OGTT)

胰岛素耐量(ITT)

血清脂质谱（TG/TC/HDL/LDL）

2. 组织学验证

金标准组合：

H&E染色（NAS评分）

天狼星红（纤维化分期）

油红O（脂肪变性定量）

3. 分子机制验证

多层次证据：

mRNA水平（qPCR）

蛋白水平（Western blot/IHC）

功能性实验（基因敲除/过表达）

4. 临床相关性分析

⑴转化医学指标：

血清CK-18片段

FIB-4指数计算

肝脏硬度检测（如FibroScan）

5. 方法学报告

必含信息：

动物品系/周龄/性别

饲料配方/供应商

取材具体时间点/条件

七、前沿解决方案展望

1. 类器官技术

应用：

⑴患者特异性NAFLD模型

⑵药物敏感性测试

⑶疾病机制研究

2. 多组学整合

新策略：

转录组+代谢组联合分析

微生物组+肝脏基因表达关联

单细胞测序解析异质性

3. 人工智能辅助

技术革新：

①数字病理自动评分

②实验条件智能优化

③数据偏差自动检测

结语：成功构建NAFLD模型的5大黄金法则

⒈严格标准化：从动物采购到数据分析全流程SOP

⒉多维度验证：代谢-病理-分子三位一体评估

⒊动态监测：设立多个时间点捕捉疾病进展

⒋质量控制：每批实验设立阳性和阴性对照

⒌临床关联：选择与人类疾病高度相似的模型系统

掌握这些问题的解决方案，您将能够建立稳定可靠的NAFLD动物模型，为深入研究疾病机制和开发新型治疗策略提供坚实基础！

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