EMSA实验详细操作步骤由普拉特泽生物旗下生物医学科研培训品牌——春风学院总结分享，快点学起来吧。普拉特泽生物自建3000平米生物实验室，专为科研人员提供真实专业的生物实验外包服务。

        1、EMSA实验前准备

        （1）合理的实验方案

        根据研究目的合理设计特异性探针实验组以及非特异性探针对照组，如有必要还可以添加特异性抗体组、特异性核酸竞争组等。

        （2）样本制备

        可以选择提取样本的总蛋白、核蛋白或者使用纯化好的目的蛋白。对样本蛋白进行定量，实验中需等量加入蛋白。

        （3）探针制备

        根据实验要求设计不同的探针并添加标记，可以合成核酸后自行添加，部分已知蛋白有商业化的抗体也可以直接购买。现在大多数实验室已经不再使用放射性标记，生物素使用相对较多。

        2、形成蛋白-探针复合物

        （1）在0.5 mL离心管中按顺序将下列组份混匀：

        蛋白样本（2-5μg） XμL

        poly d(I-C) 1μL

        Binding Buffer 2μL

        Nuclease-Free ddH2O XμL

        总体积 9 μl

        （2）冰浴5 min后，加入1 μ探针。（对照组加1ul对照探针）

        （3）PCR仪中室温（20-23℃）温育30 min。

        3、制备凝胶，电泳

        （1）制备6.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶：（注意根据试剂情况按比例调整总体积）

        5XTBE 1 mL

        30%Acrylamide/Bis 2.2 mL

        deionized,sterilewater 6.62 mL

        80%Glycerol 80 μL

        10%AP 90 μL

        TEMED 10 μL

        总体积 10 mL

        （2）按标准步骤制备凝胶。

        （3）加样前先在预冷的0.5X TBE buffer中120V预电泳10 min，与电泳完毕后冲洗加样孔。

        （4）混合样本及电泳缓冲液，点样电泳。

        （5）将电泳槽置于冰上或者4℃环境中，恒压100V进行电泳，直至缓冲液指示带距离凝胶底部2~3 cm为止。（大约50-60 min，根据实际情况调整电泳时间及电压；电泳时间不宜过长）

        4、转膜

        （1）在预冷的0.5XTBE中浸泡凝胶，膜，滤纸和纤维垫。

        （2）按如下顺序组装“三明治”：纤维垫，滤纸，凝胶，膜，滤纸，纤维垫。注意电极，确保凝胶位于阴极、膜位于阳极。

        （3）在预冷的0.5XTBE中进行转膜。转膜装置应置于冰上或者低温室中，恒压60V转膜1h。（注意根据实际情况调整电压及时间）。

        5、检测

        （1）去除转好的膜，放入合适的盛有缓冲液的容器中，冲洗。（注意整个检测过程避免膜干燥）

        （2）去掉冲洗缓冲液，加入封闭液后轻微震荡，室温封闭20 min。

        （3）加入适量的HRP酶标记的链霉亲和素（Streptavidin-HRP conjugate），室温震荡孵育45 min。（勿将酶标记物直接加到膜上）

        （4）去掉酶联物稀释液，用洗涤缓冲液洗膜三次，每次室温轻微震荡1 0 min。

        （5）配置反应底物，均匀加至膜上，室温孵育5 min。（可以在加完底物后，用薄膜轻轻覆盖在膜上，使底物均匀覆盖，注意不要产生气泡）

        （6）化学发光成像系统曝光成像（曝光时间的长短可以根据检测方法不同而进行相应调整）。
好啦，那关于EMSA凝胶迁移实验的详细操作步骤就写到这里啦，如果您还有其他的不懂可以留言和我们的技术小姐姐交流，更深入的学习哦！下期给大家讲讲EMSA实验操作过程中的注意事项，下期见！