DNA pull down实验问题答疑由普拉特泽生物分子检测平台分享，上期分享了DNA pull down实验的操作步骤，大家学习后都提出了很多关于DNA pull down实验的问题，今普拉特泽生物的技术就来一个个回答：

        问题一：DNA pull down的原理？

        DNA pull down的原理是先将含脱硫生物素的DNA pull down探针结合到链霉亲和素Beads上，再将DNA-Beads和细胞裂解液孵育，这样DNA结合蛋白便一起吸附在Beads上。洗涤掉未结合的蛋白后，再用洗脱液将DNA结合蛋白从Beads洗脱下来，得到DNA pull down产物。DNA-protein复合物既可以做Western-Blot检测特定蛋白是否与靶DNA片段结合，又可以做质谱鉴定筛选出与DNA片段可能互作的蛋白信息（如具体某个或某些转录因子/组蛋白等）。

        问题二：DNA pull down的应用背景是什么？

        DNA pull down以感兴趣的DNA序列为中心，寻找与该序列结合的蛋白质，最常见的应用是寻找某特定基因启动子区域的转录因子。

        启动子通常位于结构基因5'端上游，含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列。

        转录因子也称为反式作用因子，是一种DNA结合蛋白，它能够与真核基因的顺式作用元件特异性结合来激活或抑制基因表达。

        一个基因的启动子通常会结合多种转录因子，寻找启动子序列的特异转录因子，有助于我们理解这些启动子下游的功能基因是如何被调控的。

        问题三：DNA pull down探针怎么设计？

        DNA pull down的探针长度一般情况下控制在300-4000bp，理想区间为1000-2000bp，之所以如此设计，是因为探针太长或太短都不太好，太短结合的蛋白太少，太长的话，它会存在大量的非特异性结合（整个反应条件里面我们要求是无核酸酶的），尽量避免DNA的序列有非常多的重复结构、或者高GC含量等。

        问题四：DNA Pull down如何设计对照组？

        DNA Pull down的对照通常有两种方案，一种方案是选择一个非生物素标记的DNA序列作为对照组，将来拿到的数据，主要是去除根链亲和素的树脂结合的一些蛋白。 第二种方案是使用一个无义的序列，这个需要用生信的方法跟基因组数据比对。 也有对照用LacZ基因作为对照，这个比较多人用，我们有时候也会用GFP的序列，其实就是找一段无关序列。当然，如果为了有一些明确的基因序列需要剔除的话，我们可以用一些其他的基因序列作为对照组来做这个实验。

        问题五：与探针结合的蛋白怎么制备？

        做DNA Pull down的蛋白一般有两种，分别是核蛋白与总蛋白，这个有什么区别呢？因为DNA结合的区域，大多数转录因子，我们尽量选取核蛋白来进行，减少杂蛋白的干扰。但是有一些材料，他的细胞核或者和核蛋白非常困难，或者分离我们研究的不是跟转录因子的结合，而是跟组织蛋白或者结构蛋白结合的，这种情况下我们就选用总蛋白。

        问题六：DNA pull down与RNA pull down的差别？

        在我们大多数人的潜意识里会认为DNA pull down可能会更简单一点，但实际上RNA成功率更高，结合的蛋白会更多，这是为什么呢？这个地方就取决于我们的探针了，做DNA Pull down的时候，我们的DNA探针是用双链的，大家都知道双链的DNA探针，它会形成一个双螺旋的结构，相对来讲它是比较稳。而RNA是单链的，它会自我形成很多的这种二级结构，我贴了一张二级结构图，在二级结构的基础之上，会形成三级结构，四级结构，它就像有点像是蛋白质。它会形成一个非常复杂的空间结构，这种非常复杂的空间结构相对于DNA的双螺旋链来讲，蛋白质的结合的概率将会大大增加，因此RNA pull down，成功率将会更高一些，当然了，这个事情也不绝对，因为RNA本身不是特别稳定的，我们操作如果说不小心或者是失误的话啊，会出现降解的情况。

        好啦，那所有的问题就都回答完啦，如果您还有关于DNA pulldown实验外包的需求或者其他技术问题，也可以直接留言，我们会第一时间给到回复的哦，我们下个实验见！