目前，由PCR介导的定点突变相比于其他突变技术具有周期短、成功率高、不受酶切位点限制等优点，是使用最普遍的定点突变方法。

DNA分子中由于发生碱基对的增添、缺失或改变进而引起基因结构的改变，称为基因突变。

定点突变 （mutagenesis）是通过PCR等方法向目的DNA片段中引入突变，包括碱基的添加、删除、点突变等。该技术能迅速、高效地改变DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是研究蛋白质结构和功能之间复杂关系的有力工具，也是研究人员在实验室中改造、优化基因常用的一种非常有用的手段。

定点突变这么常见的技术，实验如何进行呢？

一步法（直接以质粒为模板）。为了更好的扩增效率，可以将正因和反向引物分开扩增，避免二聚体的产生。实验流程如下（转载自科学网mzxg的博客）：

1、引物设计

设计一对正向和方向引物。建议引物长度为30-40bp。

基本的引物设计原则就不赘述了，这里要加上一条突变引物的设计原则。

一般是以突变的碱基为中心，两边加上12-20 bp序列，若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，引物至少要11-12个base pair才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个base pair，并且合成多一条反向互补的引物。

2、各20ul体系

18ul 混合物+2uL     primer F

18ul 混合物+2uL     primer R

在两个tube中配好反应体系后，置于PCR仪进行反应，反应程序为：

98℃             1 min

98℃             10sec

60℃(可调整)     20sec          

72℃          根据质粒大小调整

steps 2-4        for 12 cycles

72℃              5 min

4℃保存

3、反应完成后，将两个反应体系混合后成40ul体系，并且补加适量的高保真聚合酶（如Q5），然后使用以上反应程序继续反应16 cycles。

4、得到的PCR产物加入1ul DpnI 酶和4ul的10*NEB cutsmart buffer消化模板质粒（原理是DpnI 酶只消化甲基化的DNA）置于37度反应1h（或者2-3h，保证处理干净）。

5、取5ul 跑胶看是否有条带，剩余的取部分做细菌转化，涂板。

6、12h 后挑取3-5个克隆送测序。

除了一步法，还有很多其他方法可以选择，比如搭桥法/重叠延伸PCR，是通过三次PCR实现的。

重叠PCR法原理图

每个突变点需要合成一对相互Overlap（重叠）20－25bp的突变引物，你的试验中需合成4对（4个点）突变引物。 另外两侧需要合成一对引物，以便扩增全长序列（称为全长引物）。

举一突变点为例，如需突变A点。先作两个PCR：1使用正向全长引物和A突变点的反向突变引物；2突变点A的正向突变引物和全长反向引物。而后回收两段PCR产物，取少量产物在PCR体系中先自延伸十周，而后加入正向和反向全长引物扩增全片断。回收第二轮的PCR产物，酶切，接入克隆载体，测序。测序结果如正确则第一个位点突变完成。 以此类推，突变剩下的位点。

优点是：成功率高，应用广泛。

缺点是：扩增的序列尽量不要太长，否则成功率不高。需要对中间产物进行纯化。

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