大家好呀，今天小编给大家分享的就是Co-IP（免疫共沉淀）实验的详细操作步骤，虽然是分子互做实验中的常规实验，但还是有很多人问咱们的技术人员实验细节，今天小编就给大家详细分享一下吧。本文由普拉特泽生物分子检测平台技术总结分享，coip作为分子检测中心已经承接了上千例关于Co-IP外包实验，积累了丰富的实验操作经验，文尾还附有Co-IP理论+实操的操作视频，爱学习的同学可以冲了哦！

   Co-IP是经典的利用抗体从样品中捕获靶蛋白及其互作蛋白、复合体的一项技术，能够特异性富集所研究的目的蛋白。

   Co-IP实验详细步骤：

   1、预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机。

   2、用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS。

   3、加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)。

   4、用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）。

   5、4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中。

   6、准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠。

   7、每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景。

   8、4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子。

   9、(Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）。

   10、用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果目的蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）。

   11、加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因目的蛋白在不同细胞系中的多少而异。

   12、4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育。

   13、加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）。

   14、14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS。

   15、用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）。

   16、将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。

   好了，Co-IP免疫共沉淀实验的详细步骤我们就讲完了，还有更多不了解的欢迎点击：《Co-IP 理论+实操》详细学习。同时，普拉特泽生物还提供专业的coip实验代做与线上下实验技能培训服务，快来咨询吧！