上两期我们给大家介绍了“有氧糖酵解”。从今天开始，我们继续给大家介绍一个相关联的代谢类型“谷氨酰胺代谢”~

首先，什么是谷氨酰胺代谢？

除了前面提过的糖代谢、脂质代谢以外，谷氨酰胺代谢也同样是细胞中一种重要的代谢方式。

谷氨酰胺代谢最早发现是在肿瘤细胞中，由于糖酵解取代其他途径，成为了细胞分解葡萄糖供能的首选方法。葡萄糖转化为乙酰辅酶A （Acetyl-CoA）进入三羧酸循环的过程被阻断。肿瘤细胞转而加速提高了细胞内的谷氨酰胺代谢水平，以维持细胞内的生物合成水平。

也因为和糖酵解途径的关联关系，谷氨酰胺代谢目前可以做单独的研究，也可以和糖酵解联合起来一起研究。

·目前的SCI发表及国自然课题的立项情况

这次和脂质代谢、糖酵解有些不同。虽然谷氨酰胺代谢研究也在各类疾病中都有所涉及（仍以肿瘤为主），且近年的报道数量也呈现上升趋势。BUT！谷氨酰胺代谢研究整体上看，无论是SCI报道量还是国自然的立项数量，都还非常少。

Glutaminolysis（谷氨酰胺代谢）：

那么老问题又来了，要是真做起来，要怎么下手呢？答案呢，嗯，也是老答案，每一个代谢方式，都有较为清晰的主要通路及各环节上的标志物。利用好这些标志物，就可以往上引入非编码RNA类、转录因子、表观遗传等研究内容。

另外也是因为谷氨酰胺代谢这个内容研究的很少很少，所以熊汉三发现即使是近年的高分，这类研究中“找出谷氨酰胺代谢参与疾病”本身就是内容最大的创新点所在。对于机制通路的新颖性、研究丰度要求倒也并不很高的说。

比如今天介绍的这篇SCI ~

这篇文献的题目是：

EGFR activates GDH1 transcription to promote glutamine metabolism through MEK/ERK/ELK1 pathway in glioblastoma

这篇是2020年1月刚刚热乎录用在Oncogene（最新IF=7.971）上的一篇关于谷氨酰胺参与调控胶质瘤的作用研究。

之前说了，从现在的研究进展来看，研究谷氨酰胺代谢本身往往就是一篇文章最大的创新点了。所以这篇文章入手选择的是一个在肿瘤中相对经典的明星基因EGFR，EGFR对肿瘤的调控作用很多。但EGFR通过谷氨酰胺代谢调控胶质瘤的作用机制，目前尚无报道。而这成为了课题组的入手方向~

① 首先，先确认EGFR对谷氨酰胺代谢是有作用的（压根儿没作用的话还玩个锤子……）：

检测不同浓度、不同刺激时间的EGF（用来激活EGFR）对谷氨酰胺代谢的标志产物α-KG（Fig 1A）,NAPDH（Fig 1B）, GSH（Fig 1C）含量的影响。发现EGF刺激（=EGFR激活）可以提高谷氨酰胺代谢水平。

② 然后找EGFR调控谷氨酰胺代谢的具体靶点：这里挑出来了9个谷氨酰胺代谢各环节的标志物，加入不同浓度、不同刺激时间的EGF（用来激活EGFR），发现只有GDH1的表达变化最为明显（Q-PCR，Fig 1D），其余几个标志物变化不明显（补充材料）

  顺便再用同位素标记法确认一下GDH1参与谷氨酰胺代谢的环节。作为一个glutamate 向α-KG转化的调节蛋白，GDH1的沉默，可以对上游的glutamate含量没有影响，但可以明显抑制下游α-KG及其下游代谢产物的含量（Fig 1E）。于是确认：参与谷氨酰胺代谢的GDH1是EGFR调控谷氨酰胺代谢的靶点。

① 因为EGFR调控胶质瘤表型的作用已经很明确了。所以这里直接从GDH1下手。先确认GDH1是有作用的（GDH1对胶质瘤并没有作用的话，表达变化再大，也没有锤子玩……）：

细胞水平：用shRNA抑制细胞内GDH1的表达，用WB验证表达效率，确认干扰效果（Fig 2A）。并发现，有效干扰下调GDH1的表达后，胶质瘤细胞的增殖活力（Fig 2B-MTT; Fig 2C-BrdU染色）受到了明显抑制。而下调GDH1的同时再次对GDH1做过表达（效果验证，Fig 2D），可以回复细胞的增值活力（Fig 2E、F）

动物水平：同样，下调GDH1的表达可以抑制移植瘤的生长，再次对GDH1做过表达后，可以“回复”肿瘤的生长。（Fig 2G、H）。

可得：GDH1可以促进胶质瘤的增殖。

② 确认GDH-1通过谷氨酰胺代谢途径调控胶质瘤（回复实验）

  上面我们介绍过，GDH1是调节一个glutamate 向α-KG转化的功能蛋白。所以首先确认一下GDH1沉默可以引起细胞内α-KG的含量降低（Fig 3A）。且外源α-KG的加入，可以逆转sh-GDH1对细胞增殖的抑制作用（MTT, Fig 3B）。先确认了GDH1通过谷氨酰胺代谢途径调控胶质瘤的增殖。

  外源EGF（=EGFR激活）可以引起胶质瘤细胞的增殖活力的升高，而同时对GDH1进行表达沉默（sh-GDH1） 或者活性抑制（R162），可以逆转EGF/EGFR对胶质瘤细胞的增殖活力的促进作用（Fig 3C、D）。同时给予高浓度的谷氨酸（重新激活谷氨酰胺代谢通路），则可以再次逆转GDH1抑制 引起的细胞增殖活力下降（Fig 3E、F）。说明，EGFR可以通过GDH1/谷氨酰胺代谢途径，调控胶质瘤的增殖。

① 先确认ELK1对GDH1的调控机制

  首先ELK1受到EGFR的调控是已有文献报道的。同时，对别人发表过的CHIP-seq数据分析，发现ELK1结合片段里存在GDH1的启动子区片段。最后再亲自下场，去JASPAR做GDH1启动子区的转录因子预测（Fig 4A），的确在GDH1启动子区预测到了ELK1的3个结合区域。

  然后确定具体是哪个位点：先对GDH1启动子区序列进行截断构建，通过CHIP实验，可以确认ELK1与GDH1启动子的结合主要发生在(-220 to -211) 的位置（Fig 4B、C）。

  最后证明：ELK1的表达沉默，可以抑制ELK1与GDH1启动子的结合（CHIP，Fig 6D），及GDH1启动子活性（荧光素酶实验，Fig 6E），进一步确认了ELK1与GDH1启动子(-220 to -211) 位点的结合作用，及通过结合对启动子活性的促进作用。

  其实课题组还做了一份大工程：Q-PCR检测到ELK1沉默可以引起GDH1的表达下降，且利用临床数据库可以分析得出，在胶质瘤组织中，ELK1的表达与GDH1成正相关。（Fig 4的结果并不多，但这部分数据他们居然选择放在了补充材料里……）

② 然后确认EGFR对ELK1--GDH1的调控机制

  这一步的主要是做文献检索，找到了既是EGFR下游，又是ELK1上游的明星通路“MEK/ERK”。

  先简洁证明了EGF刺激（=EGFR激活）可以提高MEK/ERK通路蛋白的磷酸化程度（=通路活化程度）也增加了（WB, Fig 5A）。且ELK的磷酸化（同样，=活化）水平也相应增加了（Fig 5A），与GDH1启动子的结合能力（CHIP，Fig 5B）。

  回复实验显示，对ELK1进行沉默处理。处于ELK1上游的MEK/ERK通路，活化程度并未发生改变而ELK1的表达及活化水平都有所下降（WB, Fig 5C），其与GDH1启动子的结合能力也出现了下降（WB, Fig 5D）。

而在此前提下，再次给予EGF/EGFR刺激，可以提高MEK/ERK通路的活化程度，但因为下游ELK1的总含量都受到了sh-ELK1的抑制，所以EGF/EGFR对ELK1活化及其与GDH1启动子结合能力的调控作用都不明显。

即证实了EGFR通过MEK/ERK通路，促进ELK1的活化，升高GDH1的转录表达。

③ 回复实验，最终确认EGFR对ELK1--GDH1的调控机制

  ELK1的沉默，可以逆转EGF/EGFR刺激对GDH1的表达，及下游代谢物α-KG的含量（Fig 6A）及α-KG下游各级代谢物的含量（同位素示踪+质谱分析，Fig 6B）的促进作用。但对GDH1上游的glutamate含量没有影响。

  另外还验证了ELK1的沉默可以逆转EGF/EGFR刺激对胶质瘤细胞增殖活性的促进作用（结果放在了补充材料里）

①-③ 合起来看，就证实了EGFR通过MEK/ERK通路，促进ELK1的活化，升高GDH1的转录表达，从而促进了谷氨酰胺代谢途径，促进胶质瘤细胞的增殖。

表达高/低，或笼统的通路活化/抑制参与细胞功能调控的机制很常见。但具体到研究是哪一个活化位点参与的（机制足够深入了~），就相对少了很多。这应该也是这个课题的“高分”原因之一。

首先普及一下背景知识：ELK1是通过Ser383磷酸化位点发生磷酸化，从而发生核转位入核，发挥转录因子作用的（原理如Fig 6G）。所以这里课题组想要确定，EGFR-MEK/ERK是否是通过调控Ser383磷酸化位点，调控ELK1功能的。

课题组对胶质瘤细胞一方面进行了ELK1的沉默处理（sh-ELK1）,然后对沉默后的胶质瘤细胞转入了野生型ELK1过表达质粒，和/或 Ser383位点突变型ELK1过表达质粒（Ser383A）。结果显示，两种过表达质粒都可以成功“回复”提高ELK1在细胞中的表达含量，但区别在于：野生型ELK1可以进一步“回复”GDH1在细胞中的表达含量（WB，Fig 6C），“回复”和提高ELK1与GDH1启动子区的结合能力（CHIP，Fig 6D），及GDH1启动子区的活性（荧光素酶实验，Fig 6E）。而Ser383突变型ELK1对这些功能丧失了调节作用。

相应的，野生型ELK1可以通过GDH1，最终“回复”和提高α-KG的含量（试剂盒检测，Fig 6F）。而Ser383突变型ELK1对α-KG的含量丧失了调节作用。

综上，确认了EGFR通过Ser383磷酸化位点调控ELK1的活性，并由此调节促进GDH1和谷氨酰胺代谢途径。

这份7分水平的SCI有没有觉得研究的也不是那么复杂。研究手段主要的就是MTT、WB、CHIP、荧光素酶启动子活性检测。其实就像最开始我们说的，在现在这个阶段，谷氨酰胺代谢本身就支撑起了一个课题最大的创新性，所以如果做这方面的研究，在实验手段方面要求没有太高。下次我们讲的一篇17分的文献，实验手法也同样“平平无奇”的很~

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