延续之前我们对报告基因的初步认识，今天我们来介绍一下另外的3种类型。

β-半乳糖苷酶基因（β-Gal）报告基因

β-半乳糖苷酶：由大肠杆菌lacZ基因编码，可催化半乳糖苷水解。

最大优势是易于用免疫组织化学法观测其原位表达，是最常用的监测转染率的报告基因之一。

以邻-硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）为底物可用标准的比色法检测酶活性，其检测动力学范围为6个数量级。氯酚红-β-D-半乳吡喃糖苷（CPRG）是另一个可用比色法检测酶活性的底物，其灵敏度比ONPG高近10倍。以MUG和荧光素二半乳糖苷（FDG）为底物则可用荧光法检测其活性。此法可检测单个细胞的酶活性，并可用于流式细胞学（FACS）分析。如以二氧杂环丁烷为底物，可用化学发光法检测酶活性，其检测动力学范围最大，灵敏度最高，与用生物发光法检测荧光素酶活性的灵敏度相似。

β半乳糖苷酶是动物和微生物基因工程中最常用、最成熟的一种报告基因。

它作为报告基因的应用主要有以下几个方面：

（1）用于研究启动子的效能和启动子不同位点突变对表达效能的影响；

（2）用于研究表达系统中增强序列等调控序列的功能；

（3）用来衡量载体的表达特性和外源物质对表达调控的影响；

（4） 以融合基因的形式用于研究外源基因的表达及其规律。

检测方法：

1. 用转染的细胞制备细胞抽提物。

2. 对于每个用于测定的转染细胞裂解物样品，混合：

• 100xMg2+溶液—— 3μL

• 1xONPG—— 66μL

• 细胞抽提物—— 30μL

• 0.1moL/L 磷酸钠（pH7.5) —— 201μL

3. 反应液在 37°C 孵育 30 min 或者直到淡黄色出现。大多数细胞类型中，内源性β-半乳糖苷酶的背景非常低，允许孵育时间长到 4~6 h；

4. 每管加入 500μL 1mol/L Na2CO3 使反应终止。在分光光度计上读 420nm 波长的光密度值。

常用载体：

氯霉素转乙酰酶报告基因 ( chlormnphenicol acetyltransferase, CAT)

氯霉素转乙酰酶报告基因 (CAT)：该报告基因来源于大肠杆菌转位子9，是第1个用于检测细胞内转录活性的报告基因。氯霉素乙酰基转移酶可催化乙酰CoA的乙酰基转移到氯霉素3羟基，而使氯霉素解毒。CAT在哺乳细胞无内源性表达，性质稳定，半衰期较短，适于瞬时表达研究。可用同位素、荧光素和酶联免疫吸附测定(enzyme—linked immunosorbantassay，ELISA）检测其活性，也可进行蛋白质印迹（Westernblotting）和免疫组织化学分析。CAT与其他报告基因相比，线性范围较窄，灵敏性较低。

检测步骤：

1. 转染后 24~72 h，用 D-PBSA 液洗涤细胞；

2. 将培养板置于冰上，每孔中加入 1 mL 的 Tris/Triton；

3. 将培养板-70℃ 冷冻 2 h；

4. 于 37℃ 下解冻培养板，然后将其置于冰上；

5. 将细胞裂解物移至微量离心管中，以最大速度离心 5 min；

6. 收集上清液，65℃ 加热 10 min，以灭活 CAT 抑制物质；

7. 最大速度离心 3 min 后收集上清液（细胞裂解物），将上清液保存在-70℃；

8. 从每一样品中取 5~150μL 细胞裂解物，移至一个 3.5 mL 多聚丙烯闪烁杯中，并且加入足够的 0.1mol/L Tris，终末体积为 150μL；

9. 设空白杯，加入 150μL 0.1mol/LTris 液，作为阴性对照；

10. 阳性对照：

（a）取 5 个闪烁杯，各加入 150μL 0.1mol/LTris；

（b）将 5μL 的 CAT 标准液加入到每个闪烁杯中，绘制 1、5、10、20、50mU 的 CAT 标准曲线。

11. 在所有样品杯（包括对照）中，加入 100μL 以下混合液：

（a）84μL 超纯水；（b）10μL 0.1mol/LTris；（c）1μL 的氯霉素；

（d）5μL（50nCi）的 14C-CoA；

12. 拧紧杯盖，于 37℃ 下孵育 2 h；

13. 向所有闪烁杯中加入 3 mL Econofluor，拧紧杯盖；

14. 上下倒置混匀闪烁杯中成分；

15. 室温下孵育 2 h；

16. 在一个液闪计数仪上测定 30s 闪烁次数。

注意事项：

1. 在表达质粒扩增与制备一步，要特别注意其纯度（不能含RNA和染色体DNA）以免影响转化效率

2. 制备方法最好选用溶菌酶加Triton10，然后氯化艳梯度离心。

3. 一定要有对照组用CAT酶代替细胞提取液，来验证反应及层析等过程的可行性，或用Psv:CAT表达质粒验证转化及重组两步的正确性。

4. 在制备细胞提取液中最好选用超声波破碎法，离心前要注意检查破碎程度。冻融法繁琐有时破碎不彻底影响结果。

5. 4mmol/L乙酞辅酶A可每次取1.smg溶在500纯水中，最好用前配制，配制的溶液可保存于一20℃，但不可超过十天。

常见载体：

荧光素酶（Luc）报告基因

荧光素酶报告基因是指以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶是能够催化不同底物氧化发光的一类酶，它可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。

最常用的荧光素酶有细菌荧光素酶、萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶。哺乳细胞无内源性荧光素酶，细菌荧光素酶对热敏感，因此在哺乳细胞的应用中受到限制。萤火虫荧光素酶灵敏度高，检测线性范围宽达7～8个数量级，是最常用于哺乳细胞的报告基因，用荧光比色计即可检测酶活性，因而适用于高通量筛选。随着具有膜通透性和光裂解作用的萤火虫荧光素酶的应用，无需裂解细胞即可检测酶活性。Renilla荧光素酶催化肠腔素（coelenterazine）氧化，产物可透过生物膜，可能是最适用于活细胞的报告分子。将荧光素酶报告基因载体转染到细胞中，可用荧光素酶检测系统灵敏方便地测定荧光素酶基因的表达。

自1986年起，萤火虫荧光素酶基因被用作测定基因表达的报告基因，获得了广泛的应用。Promega公司的pGL3及pGL2系列载体，含SV40启动子及增强子的不同组合，有助于分析DNA片段的转录活性。

荧光素酶报告基因有许多优点：①非放射性；②比CAT及其他报告基因速度快；③比CAT灵敏100倍；④荧光素酶在哺乳细胞中的半衰期为3小时，在植物中的半衰期为3．5小时。由于半衰期短，故启动子的改变会即时导致荧光素酶活性的改变，而荧光素酶不会积累。相反，CAT在哺乳细胞中的半衰期为50小时。荧光素酶浓度在10—16mol/L（10pS/L）到10-8mol/L（1mg/L）范围内，荧光信号强度与酶浓度成正比。在理想条件下，可检测到l0-20mol/L的荧光素酶。

检测步骤：

（1） 用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。

（2）设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒（pGL3-basic）中。

（3）筛选阳性克隆，测序。扩增克隆并提纯质粒备用。

（4） 扩增转录因子质粒，提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照，提纯备用。

（5） 培养293（或其它目的细胞），并接种于24孔板中，生长10-24小时（80%汇合度）。

（6） 将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。

（7） 提取蛋白并用于荧光素酶检测。

（8） 加入底物，测定荧光素酶的活性。

（9） 计算相对荧光强度，并与空载对照比较。

常见载体：

本期关于6种报告基因的基本介绍就到这里了，

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