相信很多浸泡在实验室的科研打工人都遇到过类似的问题：

转一个质粒或对细胞加药处理后，同一个基因的mRNA水平和蛋白水平出现了截然不同的趋势：

有的mRNA水平变高了，蛋白水平却变低；

有的mRNA水平变低，蛋白水平又变高了。

所以就陷入了无限循环的筛靶验证或重复实验中

。。。

但其实这是一种相对常见的现象，

真核生物的转录后和翻译后修饰非常复杂，而我们的认知不足以了解微观世界的一切。

背景知识

m6A(N6-methyladenosine，N6-甲基腺嘌呤）是常见的一种转录后修饰，介导了超过80%的RNA甲基化。

然而细胞内部环境复杂，不同mRNA的m6A修饰、不同细胞环境下的m6A修饰，都发挥了不同的生物学功能，需要大家深入探索并摸索规律，因此它也是表观遗传学的热点！hot！

今天小编要给大家分享的是2019年发表于《Nature Communications》（IF：13）上的一篇文章，作者使用大量的分子互作技术（RIP、CoIP、双荧光素酶实验等）探讨肝癌细胞中m6A是如何调节癌细胞EMT的。

为了便于大家理解，小编呕心沥血做了一个本文的思路导图：

作者揭示，在肝癌细胞转移的一个重要步骤—上皮-间质转化（EMT）过程中，m6A修饰的mRNA在癌细胞中增加。m6A的Writer基因METTL3的抑制下调了肝癌细胞中m6A的修饰丰度。作者还发现，Snail是EMT的关键转录因子，Snail CDS区中的m6A而不是3’UTR区的m6A触发了肝癌细胞中Snail mRNA的多核糖体介导的翻译。这项研究突出了m6A在调节肝癌细胞EMT中的关键作用。

结果解析（重点已经给大家加粗高亮显示了哦）

Fig1. 癌细胞的EMT（上皮-间充质转化）受mRNA的m6A水平调节

作者使用TGF-β诱导Hela/HepG2细胞发生EMT（补充图片里面证明了TGF-β诱导后发生EMT进程），之后使用LC-MS/MS的方法对其进行m6A的检测，发现TGF-β诱导组的m6A水平显著高于对照组（a），由此说明癌细胞EMT的发生伴随mRNA的m6A水平增高。甲基化转移酶（writers）在m6A的发生中是必不可缺的，作者之后对Hela细胞的METTL3（writers的一种）进行敲除（Mettl3Mut/− HeLa）。

Mettl3Mut/− HeLa的迁移能力以及侵袭能力显著低于Mettl3Mut HeLa（b-划痕实验，c-Transwell侵袭实验）。Mettl3Mut/− HeLa组的MMP2和FN（间充质细胞的标记物）的mRNA和蛋白水平显著低于Mettl3WT HeLa，而E-cad（与侵袭转移能力呈负相关）的mRNA和蛋白水平显著高于Mettl3WT HeLa（d，e，g），说明METTL3的敲除可抑制癌细胞的EMT进程。

为了验证m6A水平在EMT中的作用，作者进行了ALKBH5（关键的m6A去甲基酶）过表达，发现ALKBH5过表达处理与METTL3敲除处理结果一致（MMP2、FN下调，E-cad上调）（f）。TCGA数据库分析结果显示肝癌组织中的METTL3显著高于正常组织（h），且肝癌组织中 CDH1（E-cad的基因名）的表达与METTL3的表达呈负相关关系（i）。

Fig2. 在经历EMT的细胞中m6A调节的基因的变化

确认m6A在EMT中存在调控功能，那具体是哪个基因起到中间作用了呢？作者对EMT 前后细胞进行m6A-seq。在对照和EMT细胞中，GGAC基序都高度富集在m6A位点内（a）。起始和终止密码子附近的m6A峰特别丰富，且主要集中在外显子区域（b，c）。作者将对照与EMT细胞进行比较，鉴定出128个发生了1.5倍的m6A变化的基因。GO分析表明少数基因与经历EMT的癌细胞中粘附连接和肌动蛋白细胞骨架的形成有关（d）。 综上，m6A修饰发生在少数与EMT期间的细胞连接，粘附和迁移有关的基因上。

Fig3. 在癌细胞中，Snail参与m6A调控EMT进程

为了找到涉及癌细胞的m6A调控EMT的潜在靶点，作者鉴定了84个具有关键功能的EMT相关基因与61个m6A调控基因（大于2.0倍m6A变化）之间进行Overlap分析，发现4个基因在EMT前后 m6A 和表达水平发生了显著变化（a，b）。其中Snail是一个已知调控EMT 的转录因子，因此作者接下来将研究的重点放在 Snail 上。作者进行m6A RIP- qPCR，EMT组的SNAI1 mRNA的m6A水平显著高于对照组（2.3倍）（c）。与control组相比，METTL3敲除组以及ALKBH5过表达组的Snail表达水平显著降低（d）。由此确认Snail同时受到METTL3（m6A甲基转移酶）和ALKBH5（m6A甲基位点识别蛋白）的调控，即Snail的表达水平受m6A 的修饰水平调控。随后，作者对Snail在EMT中的功能进行了验证，显示Snail 可以促进 EMT 的发生，且Snail 过表达可回补METTL3缺失引起的EMT进程减缓（e，f）。

Fig4. 在癌细胞中，m6A触发Snail mRNA的翻译

前面已经证明Snail受m6A修饰调控，那调控具体发生在什么水平呢？qPCR验证发现 METTL3敲除之后，pre-mRNA和mature mRNA的表达水平显著升高（这一点结果与图3d的蛋白表达水平结果相反），且两者的稳定性也显著升高（a，c，d）；但是Mettl3Mut /-细胞中Snail蛋白水平下调，Snail蛋白的稳定性在野生型和Mettl3Mut /-HeLa细胞之间无显著差异（e），这表明m6A使得Snail mRNA稳定性降低而不影响其蛋白稳定性。在CHX（蛋白质翻译抑制剂）而非MG-132（蛋白酶体活性抑制剂）的存在下，Mettl3Mut /-HeLa细胞中TGF-β诱导的Snail表达减弱（f）。之后作者构建了pmirGLO-Snail荧光素酶报告载体，结果显示Snail在Mettl3Mut /-HeLa细胞中的翻译效率明显低于HeLa WT细胞中的翻译效率（g）。综上表明m6A诱导的Snail表达与翻译调控有关。

核糖体分析结果显示，与HeLa WT细胞相比Mettl3Mut /-细胞中80S单核糖体和多核糖体（>80S）的减少（h，i）。qPCR显示Mettl3Mut /-细胞翻译活性多核糖体（> 80S）中的Snail mRNA显着低于野生型细胞（j）。提示Snail mRNA的翻译水平在EMT过程中得到了改善。

Fig5. m6A-甲基化的CDS调节Snail的翻译

m6A-RIP seq数据显示，在Snail CDS中鉴定出1个GGAC基序，在3'UTR中鉴定出2个GGAC基序（a）。作者使用双荧光素酶实验检测发现野生型和Mettl3Mut /-细胞之间的WT-3'UTR，mut1-3'UTR和mut2-3-3UTR的Snail 3'UTR没有翻译差异（b，c）。表明3'UTR上的m6A甲基化可能不参与m6A修饰调控的Snail表达。之后作者构建了Snail CDS/MUT的表达构建体并进行相关转染实验，结果显示Snail在Mettl3Mut /-细胞中的表达显着下降（而Mut则没有如此明显效果），表明CDS中的m6A甲基化与m6A介导的Snail表达至关重要（d，e，f）。

由于YTHDF1可充当m6A“阅读器”，识别m6A甲基化的mRNA，并促进其靶标的翻译。作者使用RIP-qPCR研究了Snail mRNA和YTHDF1之间的相互作用。结果显示，YTHDF1显着富集了Snail mRNA（CDS区），而在Mettl3Mut /-细胞中，这种相对富集（IP与input）显着受到抑制（g，h）。si-YTHDF1减弱了HeLa细胞中TGF-β诱导的Snail表达（i）。综上证明YTHDF1参与SNAI1 mRNA的m6A甲基化。

接着使用RIP-qPCR检测HeLa细胞中eEF-1-和eEF-2（翻译延伸因子）结合Snail mRNA的变化。与Mettl3WTHeLa相比，Mettl3Mut /-HeLa细胞中Snail mRNA和eEF-2之间的结合显着减少（j）。CoIP分析表明，与Mettl3WTHeLa相比，Mettl3Mut / -HeLa细胞中的YTHDF1和eEF-2之间的结合显着降低（k）。综上表明YTHDF1和eEF-2可能是癌细胞中m6A诱导的Snail mRNA的翻译延伸的原因。

综上，METTL3使 Snail mRNA不稳定且降解而蛋白水平上调。究其原因可能是因为翻译延伸效率提高的原因，使得叠加调控结果为对Snail蛋白水平起正调控的作用。

（这一点在我们在日常的实验中也会经常遇到，所以先不要总是怀疑自己的数据，如果做了几次重复仍然是一样的结果，那么我们要接受它，并尝试找出其它原因。）

Fig6. m6A调节体内癌症的进展

之后作者研究了m6A甲基化对癌细胞体内转移的潜在影响。作者将sh-Con和sh Mettl3 Huh7细胞分别皮下注射到雌性裸鼠中。IHC结果表明METTL3耗竭使异种移植肿瘤组织中的Snail，FN和Vim含量降低（a），表明METTL3敲降可以降低Huh7细胞的EMT潜力和Snail表达。为了进一步确定m6A甲基化对体内转移的影响，作者进行了肺转移分析。与对照细胞相比，从METTL3 sh Huh7细胞衍生的肺肿瘤数目显着减少（b），表明METTL3缺乏抑制了体内肿瘤转移。然后将HeLa WT、Mettl3 Mut /-HeLa、HeLa Snail、HeLa Snail+Mettl3-注入裸鼠尾静脉静脉注射，结果显示与HeLa WT细胞相比，源自Mettl3Mut /-HeLa细胞的肺的肿瘤数量明显减少，而Snail的过度表达可以减弱Mettl3Mut /-HeLa细胞对体内肺转移的抑制作用（c）。提示Snail参与了METTL3的体内转移作用。

最后的最后，作者进行了临床数据的统计分析，发现与癌旁组织相比，在肝肿瘤组织中观察到METTL3（h）和YTHDF1（d）表达增加，且与肝脏中的Snail mRNA水平正相关（f，g）。高METTL3（i），YTHDF1（j）和SNAI1（k）表达的肝癌患者显示总生存期（OS）降低。