一、甲苯胺蓝（TB）染色简介

甲苯胺蓝是常用的人工合成染料的一种，属醌亚胺染料类。含有两个发色团和助色团使切片上的组织细胞着色，临床上常用甲苯胺蓝对软骨细胞和肥大细胞进行染色。

二、甲苯胺蓝染色详细实验步骤

  Step1：样本烘干：将取材后贮备进行甲苯胺蓝染色的样本放入烤箱中65摄氏度烘片30分钟，将样本风干后方便后续的操作。 
   Step2：样本脱蜡：将风干的样本放在染色架上，依次放入二甲苯I、二甲苯II溶液浸泡脱蜡各五分钟。目的是将样本中的石蜡溶解掉，蜡不溶于水，如果脱蜡不干净就会引起甲苯胺蓝染色物不均匀、阳性物时隐时现、背景染色增加等问题。所以脱蜡的时间要根据季节、温度和试剂的新鲜程度调整，如果温度较高脱蜡剂新鲜则脱蜡时间不需要太多，3-5分钟就足够，如果温度较低脱蜡剂陈旧则适当延长浸泡的时间。

  Step3：样本水化：将已经浸泡脱蜡的组织样本先放入无水乙醇I中浸泡两分钟，洗出脱蜡剂时样本中残留的二甲苯使水可以进入组织，然后再将样本置于95%、85%、75%、自来水各两分钟以达到充分水化的效果。

 Step4：样本染色：将水化好的样本切片用移液枪吸取甲苯胺蓝染色液滴加或者浸染5-30分钟，染色过程可在镜下控制，具体时间根据染色液浓度和室温等因素进行调整；染色后用流水充分清洗两分钟，再滴加1%的盐酸酒精进行分化，使细胞核中结合过多的染色液和细胞浆中多余的染色液被除去，直至细胞呈紫蓝色清晰可见；分化完成后用流水冲洗5分钟，蒸馏水冲洗1-2秒，将冲洗好的切片放入烘箱中彻底干燥。

  Step5：样本脱水：将染色干燥完毕后的样本进行脱水，分别将样本浸入无水乙醇I 30秒、无水乙醇II 1分钟。置换出染色过程中样本吸收的水分，浸泡时间因为组织大小、厚薄不同而适当调整，水脱不干净，透明剂就无法完全置换，影响切片质量。
   Step6：样本透明：将脱完水的甲苯胺蓝染色切片浸入二甲苯2分钟。组织在无水乙醇内完全脱水后透明剂(二甲苯）能把脱水剂置换出来，组织全部为透明剂填充，在光线下呈半透明状，方便后续的镜下观察和封片保存。

   Step7：样本封片: 在透明处理完毕后的组织上方滴加中性树胶，玻片稍倾斜，用手将盖片顺玻片斜面轻放，防止气泡产生。封片前需要烤干切片上的水分，否则镜下观察时有一层水雾，导致细胞轮廓不清楚。封片时只需用一次性滴管滴一两滴即可，过少导致封片不完全，过多则容易中性树胶外溢影响保存。

   Step8：镜下检查:显微镜下观察拍照并记录。

  甲苯胺蓝染色实验步骤视频点此跳转（微信荔枝微课）

三、甲苯胺蓝染色的常见问题与注意事项

1、常见问题

1）染色时间过长或过短导致的染色过深或过浅。

2）植物组织较脆，易出现掉片。

2、注意事项

   1）控制染色时间，保证染色不至于过深或过浅，必要时可在显微镜下观察控制染色时间。

  2）水洗时间不宜过长，保证阳性显色清晰可见。

 3）植物组织切片时应控制切片厚度以及摊片时间，减少掉片风险。