一、β-乳糖苷酶染色实验简介与原理

实验简介： β -半乳糖苷酶是一种是细胞溶酶体中的水解酶，能把乳糖水解成葡萄糖和半乳糖的酶。其结构基因为LacZ，与LacY（半乳糖苷透性酶）和LacA（半乳糖苷转乙酰酶）同组成乳糖操纵子，并在特异的乳糖操纵系统中的阻遏物、操纵基因、启动子等的协同下，支配调节β-半乳糖苷酶的合成。β-半乳糖苷酶一般广泛存在于动植物界中。

实验原理：绝大多数正常细胞被认为仅有有限的分裂能力，在不能分裂后就进入衰老(senescence)状态。此时细胞仍然是存活的，但细胞的基因和蛋白的表达谱发生了很大改变。衰老的细胞不能在一些常规的刺激下再诱导细胞分裂，并且衰老细胞的细胞周期分布也比较特殊，不同于一些损伤诱导的细胞休眠，也不同于细胞生长接触抑制的情况。衰老细胞通常体积变大，并表达在pH6.0时有高酶活性的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)。

二、β-乳糖苷酶染色临床意义

在临床上，β半乳糖苷酶，在肾近曲小管上皮细胞中含量较高。尿中β半乳糖苷酶活性可反映肾实质，特别是肾小管的早期损伤，与尿中N-乙酰β-D-氨基葡糖苷酶一同测定作尿酶谱分析，有助于病程观察和预后评价。如对各种肾病的鉴别诊断、药物对肾的毒性作用、感染、休克、肾移植排异反应、急性肾小管坏死等疾病的早期监测等。衰老相关β -半乳糖苷酶染（senescenceassociatedb-galactosidase SA -β-Gal）：体外培养细胞在 p H 为 6 时 , 其β-半乳糖苷酶染色的阳性率随代龄增加而增加 , 这种中性β 2 半乳糖苷酶被定义为衰老相关的β-半乳糖苷酶 ( SA 2 β 2 gal) 。血清饥饿引发的生长抑制并不能提高 SA 2 β 2 gal 的活性 ,Werner 综合症患者皮肤成纤维细胞体外培养时增殖能力的丧失快于正常人 ,同时 ,SA 2 β 2 gal 阳性细胞的积累速度也加快。永生化细胞检测不到 SA 2 β 2gal 的活性 , 转基因技术诱导永生化细胞衰老的同时 ,也诱导衰老相关β 2 半乳糖苷酶的活性。而且 ,老年个体皮肤组织切片衰老相关β 2 半乳糖苷酶染色的阳性率高于年轻个体。基于以上观察 ,人们认为这种中性β 2 半乳糖苷酶是一种很好的可用于体内外衰老研究的生物学标志。

三、β-乳糖苷酶染色实验步骤（样本与实验目的不同步骤均有不同）

Step1：将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右

Step2：脱蜡。二甲苯I10min→二甲苯II10min→梯度酒精(由高到低)各5min

Step3：1xPBS洗涤3次，每次5min。注：对于冷冻切片直接按照以下步骤进行

Step4：加入适当体积的-半乳糖苷酶染色固定液，以充分盖住组织为宜，室温固定不少于15min

Step5：1xPBS洗涤3次，每次5min

Step6：加入适当量的染色工作液

Step7：37℃孵育过夜，最好把整个切片浸泡在染色工作液中。注：37℃孵育不能在二氧化碳培养箱中进行。

Step8：1xPBS洗涤3次，每次5min

Step9：脱水:梯度酒精(由低到高)各5min→二甲苯I10min→二甲苯II10min

Step10：加上封片液封片后4℃可以保存较长时间

Step11：普通光学显微镜下观察。光学显微镜下很容易观察到变成蓝色的表达-半乳糖苷酶的细胞