非编码RNA近几年来的热度虽然有所降低，但瘦死的骆驼依然能发文章。如果没有一个新颖的靶蛋白砸到脑袋上，非编码RNA的万精油套路仍然还是广大基层科研工作者冲击高分的首选。对于非编码RNA家族的成员，各位同学最熟悉的当然是lncRNA和miRNA两兄弟了。这两兄弟通过一种叫做ceRNA（competitive endogenous RNA）的听着挺高端，其实挺简单的机制，硬是在过去的十来年往江湖里灌了不少的农夫山泉。

然鹅，好景不长，miRNA这不争气的娃娃近几年率先显了疲态，单独研究miRNA的文章分值区间一再走低，miRNA渐渐地就变成了一个傍着lncRNA这个老大哥出现的小老弟。虽然以lncRNA/miRNA/靶基因为主轴的套路依然适用于3-5分的区间，甚至在你的lncRNA足够新颖的情况下依然有能力冲击更高的分数，但是有梦想的lncRNA也开始逐渐往新的方向拓展。

那么这次就由野菜君通过几篇典型文献来给各位同学介绍4种有别于ceRNA机制的lncRNA的研究方向，如果你手头正好有一个热乎的lncRNA，又不再想走miRNA的水路，或许能从里面找到一些灵感。

（一）

LncRNA与组蛋白甲基化（histone methylation）

本节关键词：PRC2复合物，EZH2，H3K27三甲基化修饰

本节相关文献：Long noncoding RNA AFAP1-AS1 predicts a poor prognosis and regulates non–small cell lung cancer cell proliferation by epigenetically repressing p21 expression，Molecular Cancer ，IF：10.6

首先我们来看一种lncRNA在告别miRNA后最常见的路子——组蛋白甲基化。组蛋白甲基化是调控基因表达的重要方式，主要包括H3K27me3，H3K9me3，H3K4me3等等。我们以H3K27me3这种与lncRNA的相关报道最多的修饰方式为例，其含义是组蛋白Histone 3 (H3) 的第27位的赖氨酸 (K) 被三甲基化（me3）修饰，而带有这种修饰的组蛋白结合到靶基因的启动子区域，就会抑制靶基因的表达。细胞内主要负责H3K27me3修饰的是PRC2（Polycomb Repressive Complex 2）这个复合物。然后呢，这个复合物主要由EZH2, SUZ12, EED等几个亚基组成，其中EZH2（Enhancer Of Zeste 2）又是直接具有甲基化转移酶催化活性的最重要的亚基。近年来，发现PRC2以及EZH2在肿瘤中上调，通过抑制多种抑癌基因的表达，发挥促癌作用。为了方便阅读，我们可以通过一张模式图对这个机制先有一个大概的印象。

好了，介绍完背景，我们通过一篇典型文献来看看针对我们的lncRNA，如何研究它调节组蛋白甲基化的机制。这篇文献18年发表在molecular cancer上（Long noncoding RNA AFAP1-AS1 predicts a poor prognosis and regulates non–small cell lung cancer cell proliferation by epigenetically repressing p21 expression）。值得一提地是，这个杂志影响因子近几年的影响因子在5-7的区间徘徊，但是2018年神奇地蹿升到了10.6分。关于lncRNA对肿瘤基础表型的功能验证就不在此赘述了，我们直接看机制部分结果。

首先，作者通过测序和GO分析，发现在A549细胞中敲除AFAP1-AS1能够引起300多个基因上调两倍以上（Fig. 4a）以及这些基因与细胞增殖（Fig. 4b）等过程有关。当然，这一步也不是必须的，我们完全可以通过公共数据库的挖掘（比如TCGA）找出在某肿瘤中与AFAP1-AS1的表达呈负相关的抑癌基因，或直接像（Fig. 4c）和（Fig. 4d）的结果那样，选取一些经典的抑癌因子进行qPCR的验证，同时这些抑癌因子又往往是有报道被EZH2抑制的。总之，这一步就是找出调控AFAP1-AS1引起的差异表达基因。

然后呢，作者先是验证了AFAP1-AS1在核内和胞浆的表达分布，毕竟我们的H3K27me3修饰是发生在核内（Fig. 5a），再通过RIP的方式验证了AFAP1-AS1与EZH2以及SUZ12均有结合（Fig. 5b）。

小拓展：对于具体lncRNA与EZH2结合后是通过何种方式发挥作用，这个机制大多数研究都是没有再深究的。就连发表在PNAS上的lncRNA/EZH2套路文章也仅仅是探明了lncRNA上的一段富G的片段（G-rich motif）参与结合了EZH2，而关于EZH2上结合lncRNA的片段，可能存在于其N端的32–42 helix。有兴趣的读者可以自行参看这两篇补充文献深入了解（HERES, a lncRNA that regulates canonical and noncanonical Wnt signaling pathways via interaction with EZH2；Conserved RNA-binding specificity of polycomb repressive complex 2 is achieved by dispersed amino acid patches in EZH2) 。

最后，作者把下游的靶基因锁定在p21这个经典的抑癌基因，进一步验证了AFAP1-AS1和EZH2分别对p21表达的调控（Fig. 6a，Fig. 6b），同时，通过CHIP实验，发现敲除AFAP1-AS1后，EZH2以及H3K27me3在p21启动子区域的结合降低，最终导致p21的表达抑制被解除（Fig. 6c）。

至此，作者用最低碳的方式，验证了核内的AFAP1-AS1通过结合EZH2（RIP，RNA pull down实验），将EZH2募集（recruitment）到靶基因p21的启动子区域（CHIP实验），EZH2通过将该区域的H3组蛋白进行H3K27me3修饰，抑制p21的表达（WB, qPCR验证）。将之前的那个作用模式图用具体的分子代替就是这样：

当然我们也可以参考其他一些lncRNA/EZH2/靶基因的文献，进一步增加我们的实验丰度，但是核心的（最低碳的）机制基本就是该文献中展现的这样。值得注意的是，一般来说，lncRNA并不会改变EZH2的整体表达，只是将EZH2招募到启动子区域；而对于H3K27me3的整体表达，则存在lncRNA的差异性，有的会上调，有的则并不改变。

关于lncRNA与组蛋白甲基化的技术总结

1. 关键的验证内容是lncRNA与EZH2的结合，以及lncRNA对EZH2, H3K27me3在靶基因启动子区域的富集的调控。

2. 虽然此文献中没有展示，但这里强烈建议还是要加上RNA pull down的结果与RIP结果一道作为lncRNA结合EZH2的进一步的验证。

3. 一般来说不需要再深入研究lncRNA与EZH2的作用机制。

4. 除了H3K27me3，还存在如H3K4me3，H3K9me3的修饰，如果你手头的lncRNA已经有了与EZH2的报道，不妨尝试其他几种修饰。

（二）

LncRNA与RNA结合蛋白（RNA bind protein， RBP）

本节关键词：mRNA稳定性

本节相关文献：Long Noncoding RNA MEG3 Induces Cholestatic Liver Injury by Interaction With PTBP1 to Facilitate Shp mRNA Decay，Hepatology，IF：14

接下来我们再看另一种lncRNA通过非ceRNA的机制调控基因表达的方式。RNA结合蛋白（RBP），顾名思义是一类可以与RNA结合的蛋白。RBP可以通过与mRNA结合，调控mRNA的剪切（splicing），稳定性（stability），翻译起始（translation initiation）等过程，从而在翻译阶段调控基因的表达。我们通过这篇2017年发表于Hepatology（14分）上的文章（Long Noncoding RNA MEG3 Induces Cholestatic Liver Injury by Interaction With PTBP1 to Facilitate Shp mRNA Decay），来了解一下经典的lncRNA+RBP的套路。同样，我们先看一张机制图来对这个机制有一个初步的理解。

作者一上来就直奔主题，筛选和验证能够与lncRNA MEG3结合的RBP：通过有义链（sense）和作为阴性对照的反义链（anti-sense）的MEG3探针（Fig. 1A），进行RNA pull down后在SDS-PAGE胶上进行考马斯亮蓝染色（非特异的染蛋白质），通过对比anti-sense和sense链的差异条带（Fig. 1B，箭头所示），将该部分胶进行质谱分析，发现其中所包含的几十种蛋白中含有PTBP1（正文未展示，补充材料），接着再通过RNA pull down（Fig. 1C）以及RIP（Fig. 1D）实验进一步确认了MEG3与PTBP1的结合。

接下来，作者通过预测软件（RNAmap，starbase 2.0）找到了与PTBP1结合的mRNA SHP（Fig. 2A）。然后在三种细胞中通过RIP验证了SHP mRNA与PTBP1的结合，并且这种结合会受到MEG3过表达的促进（Fig. 2B）。发现没有，与ceRNA的竞争结合的机制相反，lncRNA在结合RBP后，并不会导致与靶基因mRNA结合的RBP减少，而是促进RBP与mRNA的结合。进一步地，通过RNA pull down实验，作者验证了PTBP1与SHP mRNA的哪一部分结合（CDS，3’UTR）（Fig. 2C）。最后，通过mRNA降解实验，作者验证了过表达MEG3和（或）PTBP1能够促进SHP mRNA的降解（Fig. 2D）。

至此，我们可以跟着下面所示的这篇文献的思路图，总结lncRNA/RBP/靶分子的研究套路，先通过RNA pull down/质谱筛选和确认与lncRNA结合的RBP分子，并使用RIP和RNA pull down进行验证；再通过预测找到与RBP结合下游靶分子mRNA，通过RIP，RNA pull down验证lncRNA是否影响RBP与mRNA的结合，最后通过mRNA降解实验验证lncRNA以及RBP对mRNA的表达的变化的影响。

小拓展1：RBP分子并不像miRNA或是EZH2一样，仅对下游mRNA或基因产生抑制。在上文分享的例子中，PTBP1是降解靶基因的mRNA的，但是也有文献报道PTBP1能够增加某些mRNA的稳定性（Long noncoding RNA ANCR inhibits the differentiation of mesenchymal stem cells toward definitive endoderm by facilitating the association of PTBP1 with ID2），或通过选择性剪切的方式调控mRNA（PTBP1-Mediated Alternative Splicing Regulates the Inflammatory Secretome and the Pro-tumorigenic Effects of Senescent Cells），这也使得RBP的设计套路更加灵活。

小拓展2：关于lncRNA到底是如何影响RBP与mRNA的结合，与上面的EZH2一样，一般也少有深入研究，诚如上述这篇14分的hepatology也只是在讨论里阐述了几种可能的机制（见下方截图），留下一句future studies would be necessary让人浮想联翩，想要深入探索的同学不妨朝这方面入手（慎重），想要在自己的讨论里吹吹水的同学也可以多作借鉴（推荐）。

关于lncRNA与RBP的技术总结

1. 关键的验证内容是lncRNA与RBP的结合，以及lncRNA对RBP与mRNA结合稳定性的调控

2. 一般来说不需要再深入研究lncRNA与RBP的机制

3. RBP存在功能多样性，可以正向，负向调控下游mRNA的稳定性

4. 如果没有做质谱的条件，也可以参考预测软件的结果找到lncRNA可能结合的RBP

好了，考虑到大家可能已经开始出现看文献时易发的头晕，恶心的症状，本期先为大家介绍两种lncRNA在离开miRNA后的机制研究方向：第一种是lncRNA通过调控H3K27me3组蛋白甲基化；第二种是lncRNA通过RBP调控mRNA的稳定性，觉得有点启发的同学可以在清醒后继续关注，在下一期中我们会为大家带来另外两种不同于ceRNA的机制。