七夕快乐！没有对象的同学来跟普拉特泽生物一起继续学习哦~今天咱们来继续学习的是SNP检测。上期我们讲完了Taqman探针法检测SNP分型，不记得的可以回去复习哦。今天来学的是用直接测序法检测SNP的详细操作步骤，一起来看看吧：

        一、样本基因组DNA的提取

        1. 取50 mL血样于离心管中，加PBS缓冲液至1.5 mL，轻轻地摇匀。冷冻离心机6500 rpm离心10 min，去掉上清液，保留沉淀物。重复洗2次。

        2. 向保留沉淀物的离心管中加入DNA提取液500 mL，15 mL的蛋白酶K，混匀放入55℃水浴锅中消化过夜。

        3. 将消化过夜的反应液冷却至室温，加入等体积冰冷的饱和酚溶液，盖紧离心管盖，缓慢地来回颠倒10 min（在冰上进行），形成均匀的乳浊液。

        4. 冷冻离心机12000 rpm离心10 min。

        5. 小心地吸取上层水相至新管，用等体积饱和酚再抽提一次。

        6. 用等体积的氯仿再抽提一次。

        7. 离心后再取上清液于另一离心管中，加入1∕10体积3mol/L的NaAc使终浓度达到0.3mol/L，并加2倍体积冷的无水乙醇，上下倒置混匀，置-20℃冰箱沉淀30-60 min。

        8. 冷冻离心机12000 rpm离心10 min，弃上清液。

        9. 加入500 μl 70%冷乙醇小心洗涤沉淀。冷冻离心机6500 rpm离心5 min，弃上清，用干净的吸水纸或用吸头将管壁残留的乙醇去除，干燥10～15 min，不要等沉淀完全干燥，否则难以溶解。

        10. 沉淀于100 μl超纯水中。

        11. 将提取的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳及浓度的测定。

        二、SNP分型检测

        1. 引物的设计与合成

        (1) 查阅文献，参考文献中的引物，直接合成；

        (2) 根据SNP的位置找到其序列，设计引物并合成；

        2. PCR扩增片段

        (1) PCR扩增体系；

        (2) PCR扩增程序；

        (3) 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；

        (4) A. 测序法：对目的条带进行切胶回收纯化测序，根据测序结果统计分析各个样本下该SNP的基因型；

             B. 酶切法：一般这种方法都有文献支持，在前期可以确定好对应的内切酶。根据内切酶的反应体系将PCR产物进行酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。根据酶切条带来统计分析各个样本下该SNP的基因型。

        三、SNP检测

        1. 引物的设计与合成

        根据基因的序列设计扩增片段引物并合成。

        2. PCR扩增片段

        (1) PCR扩增体系：

        (2) PCR扩增程序：

        (3) 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

        (4) 将目的条带进行切胶回收纯化测序，将测序结果与NCBI库进行比对，找出各个样本目的基因突变的位置和形式，对结果进行汇总分析，计算某一种突变所占的百分比，根据结果找出关联性很强的几个突变位点，即为标签突变位点。将这些突变位点与NCBI中SNP库进行比对分析，找出新发现的突变位点，可用于后续的验证和研究。

        好啦！那直接测序法检测SNP分型的具体实验步骤就介绍到这里啦，如果您有什么实验相关的技术问题或者SNP检测实验外包的问题欢迎留言~