细胞冻存与复苏的操作步骤与注意事项由普拉特泽生物跟大家一起详细学习。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术。普拉特泽生物细胞实验平台提供多种细胞实验代做与细胞质粒购买的服务，拥有自己的的细胞库，所有细胞的冻存与复苏是非常重要的常规操作，从未出现一例细胞保存相关的失误和错误。多年操作中也总结出了自己的一套细胞冻存与复苏操作的详细步骤与注意事项，今天传授给大家，建议全文背诵~

        细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。那现在我们来看看细胞冻存与复苏的操作步骤：

        一、细胞冻存的详细操作步骤 

        1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；

        2. 取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。

        3. 去除PBS，加入适量胰蛋白酶（覆盖培养皿表面）把单层生长的细胞消化下来；

        4. 离心1000rpm，5min；

        5. 去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；

        6. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；

        7. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；

        8. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

        二、细胞复苏的详细操作步骤

        1. 提前打开水浴锅，将水温调至37℃，将需要用到的培养基放入水浴锅预热。

        2. 复苏时，将冻存细胞放入水浴锅中快速摇晃使细胞在1~2min内迅速解冻。

        3. 准备一只15ml离心管，加入5ml培养基，将解冻后的细胞悬液吸出放入到离心管内混匀，

        盖上盖子，放入离心机内，1000rpm离心5min。

        4. 离心完毕，用移液枪小心吸 去上清，加入1mL培养基重悬细胞。

        5. 将细胞悬液转移至培养皿或培养瓶中，补充适量培养基，将细胞吹打均匀，置于37℃，5%CO2培养箱培养。

        6. 这样我们就完成了细胞的复苏的流程，复苏后的细胞通常在24小时内会贴壁，第二天我们取出细胞便可以在显微镜下观察细胞的状态。

        三、细胞冻存与复苏操作的注意事项

        1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。

        2. 冻存液：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作 较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤。

        3. 离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。

        4. 细胞贴壁少：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液，而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。

        6. 复苏细胞分装：复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。

        7. 加培养基的量：加培养基的量主要和DMSO的浓度相关，如果加培养基的太少，DMSO的浓度就会比较大，会影响细胞生长。从文献资料上看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有影响。还有一个说法是1％，所以如果冻存液的浓度是 10％DMSO，那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。

        好啦，那关于细胞冻存与复苏的详细操作步骤与注意事项咱们就介绍到这里啦，如果您有细胞实验外包与细胞购买的需求的话欢迎留言，细胞实验平台的技术会及时给到回复的哦！

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