Western blot（蛋白质免疫印迹）实验操作常见问题原因及由普拉特泽生物旗下生物科研培训品牌《春风学院》总结分享，我们提供线上WB检测实操视频培训和线下WB实验外包服务，拥有自己的实验室与优秀的技术团队，真实值得信赖。

   前两篇我们总结了Western blot实验结果中背景较高、无目的条带、中杂带较多、条带大小与理论值位置不符等常见问题，今天来学习WB实验操作时最容易碰见的最后一些问题吧，希望大家引以为鉴，能够避免这些普拉特泽为大家踩过的坑。

上篇：Western blot检测实验常见问题原因以及解决方法（上）

中篇：Western blot检测实验常见问题原因以及解决方法（中）

   链接奉上，大家快点踩着春风学院的肩膀去摘苹果吧！那现在我们来接着总结：

   常见问题一、Western blot实验结果中无信号或显示信号弱

   原因1：WB检测样本不表达目的蛋白；

   解决方法：选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。

   原因2：WB检测样本低表达目的蛋白；

   解决方法：提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂，或跟着春风学院的WB实操视频教程一起操作~

   原因3：转移不完全或过转移；

   解决方法：可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过头，适当调整转膜的时间和电流。

   原因4：抗体不能识别测试种属的相关蛋白；

   解决方法：购买抗体前应当查阅文献结合自己的蛋白样本认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。

   原因5：二抗与一抗不匹配；

   解决方法：Western blot实验前查阅文献，选择针对一抗来源的种属的抗体。

   原因6：wb洗膜过度；

   解决方法：洗膜时间不要太长，适当减少，加入的去垢剂不要过强或过多。

   常见问题二、Western blot实验结果其它问题

   问题1：反影或膜上可见黄色条带；

   解决方法：一抗二抗抗体浓度过高或样本上样量过大，导致酶被瞬间消耗。

   问题2：转膜后白色空点；

   解决方法：转膜三明治制备时有气泡，转膜时将气泡排除干净，或者抗体孵育不均匀，应在摇床上孵育。

   问题3：WB检测结果中有黑色斑点背景；

   解决方法：封闭液颗粒残留，在使用前应充分搅拌至均匀溶解。

   问题4：条带拖尾；

   解决方法：样品内有不溶物，离心或者优化样本蛋白提取；上样量过载，降低上样量；使用凝胶浓度不合适，蛋白分辨率较低，调整交联剂比例；电泳液反复使用多次，重新配置新鲜电泳液。

   问题5：条带粘连，无孔间间隙；

   解决方法：胶没凝好，蛋白上样量过大，适当降低蛋白上样量。

   问题6：条带显白色（反白）；

   解决方法：目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高，适当降低一抗的浓度。

   问题7：蛋白分子量偏低或偏高

   解决方法：胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶，小分子蛋白要用高浓度胶。

   好了，到此为止Western blot实验所有的常见问题原因以及解决方法我们就总结完了，秃头小宝贝们学会了吗？拨开蛋白质免疫印迹实验的的层层迷雾，也没有那么复杂和困难是不是，想要详细学习实验操作的同学们可点击《Western Blot实验理论+实操》观看学习哦！

   如果你总是在做实验时总会遇上这样那样的问题需要帮助时，请记得call我：普拉特泽！