WB实验检测介绍由普拉特泽生物病理实验平台为大家总结分享。普拉特泽生物为广大科研人员提供长期稳定的实验研究技术服务，本文给大家分享咱们技术员长期总结下来的动物组织WB实验检测。

一、实验目的

利用Western Blot技术检测各样本中目的蛋白的相对含量

二、实验步骤

1.蛋白提取

(1)样本的收集：

细胞：用1 mL生理盐水对离心下来的细胞进行洗涤，同时将其转移至1.5 mL的离心管中。

组织：取适量组织剪碎，研磨匀浆。

(2)按1 mL裂解液加10 μL PMSF (100 mM)，摇匀置于冰上。PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。

(3)根据细胞量的多少，每管细胞加100-500 μL含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min。

(4)4℃下12000 rpm离心10 min。离心后的上清分装转移至1.5 mL的离心管中，用于蛋白定量检测。若不能及时定量蛋白浓度，请置于-80℃保存。

2.蛋白定量及处理（BCA法）

(1)使用时将BCA试剂盒中 Solution A摇晃混匀，根据样品数量，按50体积Solution A加1体积Solution B (50:1) 配置适量BCA工作液，充分混匀后即成淡绿色的工作液。BCA工作液室温24 h内稳定。

（2)将标准品 (1mg/mL BSA) 按0、1、2、4、6、8、10 μL的量分别加入96孔板中，再加入去离子水将所有标准品补足到10 μL。

（3)加1 μL的样品到96孔板中，加去离子水补足到10 μL。

(4)各孔加入200 μL BCA工作液，轻轻用移液器吹打混匀（注意不要产生气泡以免影响读数），37℃孵育30 min。

(5)冷却到室温后，用酶标仪测定A562的吸光度值。

(6)根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。

(7)蛋白变性处理：蛋白溶液与5×Loading buffer 按照体积比4：1混匀（此时蛋白浓度变成实际检测浓度的0.8倍），置于沸水中煮10min，冷却后进行SDS-PAGE电泳，或储存于-80℃，避免反复冻融。

(8)蛋白浓度的计算公式

举例标曲为：Y=aX+b（Y为OD值，X为测定浓度）

样品蛋白浓度=[（Y-b）/a]×稀释倍数

3. Western Blot

(1)配制分离胶和浓缩胶：根据目的蛋白分子量大小，配分离胶和5%浓缩胶。

蛋白分子量（kDa）分离胶浓度%

     10-2515

     15-5512

     25-7010

     35-1008

     70-3006

(2)上样：计算含20~80 μg蛋白的溶液体积，即为上样量。用1×Loading buffer 补至每个加样孔的总体积一致。

(3)电泳：浓缩胶电压为80 V，40 min，分离胶电压120 V，30-50 min。溴酚蓝跑至胶底即可终止电泳，进行转膜。

(4)转膜：恒压100V，0.45/0.22 μm PVDF膜。

(5)封闭： 将PVDF膜完全浸没在5% milk-PBST或5% BSA-PBST中，室温轻摇60 min或4℃过夜。

(6)一抗孵育：用5% BSA-PBST稀释一抗，4℃孵育过夜。

(7)洗膜：次日取出PVDF膜，PBST洗膜5次，每次6 min。

(8)二抗孵育：PBST稀释二抗，室温孵育60 min。

(9)洗膜：PBST洗膜5次，每次6 min。

(10)显影：ECL A和B液按体积1:1混合后均匀滴加在膜上，按需求设置曝光时间及曝光类型，开始曝光，曝光结束后保存图片并导出图片。

4.图像分析

用图像分析软件Image J对图像进行灰度分析。

WB实验灰度分析

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