Tunel染色实操注意事项由普拉特泽生物——病理实验平台技术为大家总结分享。Tunel是分子生物学与形态学相结合的研究方法，能准确地反映出细胞和组织凋亡的典型生物化学和形态特征，普拉特泽生物承接细胞、组织样本细胞凋亡检测外包几百例，总结出操作过程中容易被实验员忽略的注意事项，分享给大家：

        1、Tunel检测固定注意事项

        （1）固定液建议使用4%的多聚甲醛（PBS）进行固定，不建议选用乙醇和甲醇，也不能选用甲醛替代，因为市面上购买得到的甲醛大多含有甲醇。这会使我们后续的染色过程中标记效率降低，难以观察到荧光。

        （2）固定液的浓度不可过高，浓度过高的固定液会使组织边缘迅速固定，影响液体的穿透，影响固定效果，导致组织中心的细胞自溶、DNA链不规则断裂等情况的发生，实验结果出现假阳性。

        （3）固定时间不可过长，太长的固定时间会影响试剂的染色效率。

        2、Tunel检测需充分脱蜡水化

        脱蜡可以先 60°C 20 min，再用使用二甲苯两次 5-10 min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀。

        3、Tunel检测孵育注意事项

        一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用 10-30 min，几 μm 切片用短时间；几十 μm 切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，又能够使后面的酶和抗体进入胞内。实验结果出现的假阳性也可能与Tunel染色孵育步骤有关，Tunel染色液孵育时间过长，可能会出现非特异性荧光。

        4、适当延长Tunel反应液的时间

        一般是37°c 1 h，也可以根据细胞凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至 2 h，但要结合你最终的背景着色。

        5、Tunel检测操作避光

        荧光在普通光照下不能长时间保持荧光，所以，在进行需要避光操作的步骤时，我们要严格进行避光操作，避免荧光淬灭导致不能对实验结果有准确判断。

        6、Tunel检测轻柔操作

        贴壁细胞在加药诱导凋亡后，细胞状态会发生改变，细胞形态皱缩边缘，其贴壁粘附力降低。在对此细胞进行实验染色时，需要小心操作，避免吹打造成的细胞脱落，尤其是我们在对细胞的多次洗涤时操作更要小心轻柔。

        7、Tunel检测曝光注意事项

        在进行荧光显微镜观察时，根据显微镜的不同，具体参数曝光时间建议在1000ms以内，增益参数建议在500%以内，或不开增益曝光时间控制再2000ms以内，过度曝光也会增加实验的假阳性。

        好啦，Tunel染色操作时的注意事项咱们就介绍完啦，希望能够在实际的操作中真正帮助到您，得到一个清晰漂亮好分辨的实验结果。当然您若是有Tunel染色实验或细胞凋亡检测外包与代做的需求的话，欢迎直接留言，普拉特泽生物随时在线。