TSA多重免疫荧光技术，也称为多重免疫组化（mIHC），是一项能在给定组织切片上，以逐步增加能量的方式同时检测多种目的蛋白的技术。
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——下面，就为大家带来TSA多色免疫荧光技术的详细教程。

一、实验原理

TSA技术利用辣根过氧化酶（HRP）对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记。在过氧化氢（H2O2）环境中，非活性的酪胺分子（T）被二抗偶联的HRP催化激活，发生大量的酶促反应
成为具有短暂活性的中间态分子（T*）并形成共价键结合位点与邻近蛋白（包括靶抗原蛋白、一抗、二抗及HRP）的富电子区域（如色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基）发生共价偶联而沉积。
偶联在酪胺分子上的荧光染料从而在共价偶联蛋白周围大量沉积，使信号被有效放大。

二、实验步骤

【1】脱蜡复水‌

1.1将切片放入烤箱中，60-65℃烤片，时间根据切片厚度和实验室条件调整，一般在1-2小时之间。之后立即放入二甲苯或环保型脱蜡液中进行脱蜡，重复3次，每次10分钟。

1.2将切片放入梯度乙醇中进行水化：100%乙醇5分钟，重复2次；95%乙醇5分钟；90%乙醇5分钟（此步骤可根据需要选择是否进行）；80%或75%乙醇5分钟。之后用灭菌水洗片1分钟，重复3次。

【2】抗原修复‌

1.1将脱蜡水合后的玻片置于修复杯中，用抗原修复液（如柠檬酸、柠檬酸钠或EDTA等）浸没。

1.2将修复杯置于微波炉内高火煮沸，之后低火维持15-20分钟。修复完成后，取出室温自然冷却至室温，或用冰水快速降温。

【3】封闭‌

1.1去除玻片上残存洗液，用组化笔或免疫组化笔在组织周围画圈。

1.2滴加适量封闭液，覆盖样本区域，室温封闭30分钟。

‌【4】一抗孵育‌

1.1去除玻片上的封闭剂，用移液器滴加稀释的一抗溶液，浸没样本区域。

1.2室温或37℃保湿振荡孵育1-2小时（需针对不同抗体做优化调整）。

1.3用1×TBST buffer浸洗玻片3分钟，重复1-3次。
【5】二抗孵育‌

1.1去除玻片上残存的洗液，直接滴加与一抗相对应的二抗工作液（HRP标记），浸没样本区域。

1.2室温保湿孵育10分钟。

1.3用1×TBST buffer浸洗玻片3分钟，重复1-3次。

【6】‌TSA信号放大‌

1.1去除玻片上残存的洗液，滴加TSA工作液（用信号放大反应液按一定比例稀释），浸没样本区域。

1.2室温保湿振荡孵育10-15分钟。

1×TBST buffer浸洗玻片，室温浸片3分钟，重复3次。之后进行微波修复洗脱，室温自然冷却至室温。再用灭菌水洗片1次，1×TBST buffer浸片2分钟。

【7】重复染色‌

如果需要进行多色标记，则重复步骤2至步骤6，但每次需更换不同靶蛋白的抗体和不同激发波长、发射波长的TSA染料。

‌【8】细胞核染色‌

去除玻片上残存洗液，滴加DAPI工作液，室温保湿孵育5-10分钟。1×TBST buffer浸洗玻片，室温浸片3分钟，重复3次。之后用灭菌水洗片2分钟。

【9】‌封片‌

1.1待玻片微干，用移液器在玻片上滴加抗淬灭封片剂，浸没样本区域。

1.2加盖玻片，用指甲油封片。

【10】‌封片‌‌成像‌

使用全光谱成像设备、标准荧光显微镜或多光谱组织成像系统对多重染色切片进行扫描成像。

三、注意事项

1.实验前应设计好实验方案，包括一抗与TSA荧光染料的搭配以及染色的顺序。

2.尽量选择特异性高的一抗，以确保染色结果的准确性。

3.低表达指标尽量与高亮度染料搭配，高表达指标与低亮度染料搭配，以优化染色效果。

4.实验过程注意避免切片干燥，以免影响染色结果。

通过以上步骤，你就可以掌握TSA多色免疫荧光技术的基本操作方法了。希望这篇教程能对你的实验工作有所帮助！好还有关于TSA多色免疫荧光技术更多问题咨询的欢迎留言哦
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