Th细胞亚群检测步骤由普拉特泽生物为大家总结分享。上期小编给大家介绍了淋巴细胞亚群检测的原理与临床意义，忘记可以回去复习。本期小编为大家分享的是以T细胞亚群为例的淋巴细胞检测实验步骤与方法，普拉特泽生物流式检测平台承接流式检测实验服务上百例，长期提供稳定专业的淋巴细胞亚群检测外包服务，欢迎咨询。

        细胞亚群的检测方法种类繁多，大多都是根据细胞表面抗原及其抗体的特异性反应设计的。随着单克隆抗体的问世及各种检测方法的建立，淋巴细胞亚群检测已经在临床上得到广泛应用。目前，流式细胞术（FCM）为淋巴细胞亚群检测的标准方法。

        那么现在跟小编一起来看看，以人血和小鼠Th细胞亚群为例检测的操作步骤吧~

        1、外周血单个核细胞的分离:取肝素抗凝正常人或者Balb/c小鼠外周血1.5mL。在试管内加入淋巴细胞分离液3mL将外周血以等体积Hanks液稀释后，轻轻加入淋巴细胞分离液上层。2000g离心20 min。取出试管后，轻轻吸取液相交界的单个核细胞,加入Hanks液3mL混匀后，1500g离心5 min。弃去上清，细胞加入0.5mLRIMI1640培养基(含10%小牛血清，50ug/mlpenicillin和50ug/mlsteptomycin)重悬，血细胞计数仪计数，调整细胞浓度。

        2、不同浓度的HMA刺激后人T淋巴细胞CD4D8和CD3的表达。24孔细胞培养板中，每孔加入约5x10⁵个细胞，加入RPMI1640培养基至总体积1mL。加入不同浓度的HMA(10ng、20ng和50ng终浓度)和500ngmlIonomycin共同刺激人外周血单个核细胞同时加入0.7uLGolgistop37℃O孵箱刺激4h。收集单个核细胞分为三部分，分别加入CD8-CYC CD4-CYC CD3-APC单抗各10uL，室温避光孵育30 min。加入红细胞裂解液(FACSLysingSolution)lml裂解残余红细胞，2m1PBS洗涤细胞一次。流式细胞仪(FACSCaliburBectonDickinson)检测细胞,Cellquest软件获取分析细胞，每个检测获取10000个细胞。采用前向角(FSC)和侧向角(SSC)散射光散点图设门区分淋巴细胞，以直方图分别表示CD3、D8和D4阳性淋巴细胞。

        3、不同时间HMA和离子霉素刺激后小鼠T淋巴细胞CD4和D的表达。24孔细胞培养板中，每孔加入约5x105个细胞，加入RHMI1640培养基至总体积1mL。加入HMA和Ionomycin使终浓度分别为100ng/ml和1ug/ml，同时加入0.7μLGolgistop。37度二氧化碳孵箱刺激8h 12h分别收集细胞。采用抗小鼠CD4-CYCCD8PE抗体标记T淋巴细胞，流式细胞仪检测CD4和CD8的表达。

        4、流式细胞术检测人外周血Th1和Th2细胞。分离外周血单个核细胞，加入20ng/mlPMA和500ng/ml离子霉素刺激4h后，收集细胞。将细胞分为两份，称为对照管和实验管，分别加入CD3-APCCD8-PercP10uL，混匀，室温放置20 min，加入红细胞裂解液lmL混匀，室温放置10 min，1000g离心5 min，弃上清。加入Cytofix/Cytopemm液200μL，4℃放置20 min，使细胞固定穿孔。加入PemWash液lmL1500g离心5 min，弃上清。实验管加入IFN-V-FITCIL-4-PE各5ul，对照管加入同型对照抗体，4℃避光孵育30 min。加入PemWash液500μL洗涤两次。最后以300ul洗涤液重悬细胞。采用FACScom软件及CD3-APCCD8-PercP、IFN-V-FITC、IL-4-PE抗体单双标记的淋巴细胞调节仪器的补偿，采用Cellquest软件获取分析细胞。以前向角(FSC)和侧向角(SSC)散射光散点图设门区分淋巴细胞，以D3和D8散点图设门区分Th细胞(D3+D8)。最终以IFN-y和IL-4的散点图表示Th1细胞和Th2细胞。

        5、流式细胞术检测小鼠外周血Th1和Th2细胞。分离外周血单个核细胞，加入100ng/mlPMA和1ug/ml离子霉素刺激5h后，收集细胞。将细胞分为两份，称为对照管和实验管，加入CD4-CYC10ul，混匀，其余步骤同人的检测。调节仪器的补偿，采用Cellquest软件获取分析细胞。以前向角(FSC)和侧向角(SSC)散射光散点图设门区分淋巴细胞，以CD4直方图设门区分Th细胞(D4)，以IFN-v和IL-4的散点图表示Th1细胞和Th2细胞。

        那Th淋巴细胞亚群检测步骤就讲完啦，如果您还有其他的检测方法或有淋巴细胞亚群检测外包的需求欢迎随时留言~咱们下个实验见！