因为这周看文献恰好瞄到一篇今年6月发表在oncogene上的研究，主题是关于lncRNA调控大名鼎鼎的m6A修饰。鉴于m6A的名声在外，我觉得非常有必要写这篇文献的解读作为lncRNA摆脱miRNA专题的补充。那么，开始学习吧~

说起m6A（N6-methyladenosine）修饰，确实是最近几年国自然的香饽饽。2018年国自然批准的项目中，m6A相关的研究多达65项，相比2017年翻了3倍；而到了2019年，m6A项目达到179项，比2108年又翻了一倍多。其实，早在1974年，m6A就被研究者检测到(Desrosiers et al. 1974, Perry & Kelley 1974)，但由于缺乏检测mRNA中m6A位点的方法，研究人员无法识别包含m6A的单个RNA，研究者对m6A作为mRNA调控模式的兴趣很快消退。MeRIP-Seq最近技术的进步使得对m6A残基的全转录组鉴定成为可能，这使得这一生物学标记成为新的研究热点。

我们先来简单了解一下m6A修饰的过程。m6A修饰指的是RNA上的腺苷酸（A）的第六位N发生甲基化。参与m6A的蛋白可以分为writers，erasers和readers三类，其中writers往核苷酸上添加上甲基，erasers去掉核苷酸上的甲基，readers则是能够识别带有甲基修饰的核酸序列。通过下面这张图我们可以更好地了解这三者是怎么行使功能的。

可以看到，m6A writer 复合物 (RBM15/15B-WTAP-METTL3-METTL14)和m6A eraser (ALKBH5)主要定位在细胞核内。因此，m6A对mRNA的任何动态调控都会在mRNA输出之前发生在细胞核中。在细胞核中的m6A“印记”本质上是不可改变的，并决定了mRNA在细胞质中的命运。在细胞核中，m6A可以被m6A reader识别（YTH蛋白DC1）。在细胞质中，m6A可以被YTH蛋白DF1、DF2和DF3的识别。

 好了，了解了m6A的基本情况，我们来看看这篇文献是怎么让lncRNA在中间插一jio的。（LN4C92                   promoting METTL14-mediated m6A methylation in breast

    cancer cell proliferation and progression，oncogene，IF：7.9，涨分了）

我们先通过机制图来了解一下全文的大概思路。在乳腺癌细胞中，一条思路（支线）是，LNC942上调writer复合物组成蛋白之一的METTL14的 mRNA稳定性，使得METTL14蛋白表达升高。另一条思路（主线）是，LNC942与METTL14蛋白特异结合(+176 - +265)，增加METTL14的甲基化酶活性，上调下游靶点CXCR4、CYP1B1 m6A甲基化水平，进而增强CXCR4、CYP1B1的mRNA稳定性和表达。

接下来我们看看具体的结果。作者先是在正常乳腺细胞系（MCF10A）和乳腺癌细胞系（MCF7）中进行测序得到差异表达基因，找到了LNC942这个高表达的lncRNA（fig1a），同时在多种乳腺癌细胞系中进一步验证了LNC942的高表达（fig1b）。然后，通过starbase这个综合性的预测网站，作者发现LNC942可能能够与许多m6A相关的蛋白结合。所以在fig1c中，作者通过m6A dot blot assay验证了m6A在各乳腺癌中的水平，发现在MCF7和SKBR3细胞中表达最高。然后，通过shRNA构建LNC942敲低的细胞系（fig1d）。

接上图，作者发现敲降LNC942后，能够显著降低METTL14这个m6A writer复合物中的组成之一的表达（fig1e）。在组织水平，通过ISH, IHC, qPCR，验证了LNC942，m6A，METTL14的表达在乳腺癌中升高（fig1f，fig1g）。最后，使用相关性分析，验证了LNC942与m6A以及METTL14之间存在正相关（fig1h）。注意：在临床水平中验证你的关键分子A和B是否存在相关性是非常重要的证据。如果没有数目可观的临床样本，可以借助TCGA数据库来进行分析。

接下来作者从两条线验证了LNC942对m6A的调控，其中一条是直接调控METTL14的mRNA的稳定性。关于作者通过qPCR以及WB验证沉默LNC942能够抑制METTL14的mRNA和蛋白水平的结果由于篇幅的关系就不展示了，我们还是来看核心机制的验证。在fig2f中，通过加入转录抑制剂处理细胞，发现细胞内残留的METTL14随时间减少（降解），而沉默LNC942能够加速mRNA降解的速度。另外，m6A dot blot assay实验验证了LNC942沉默能够降低细胞整体的m6A水平（fig2g）。其实我们可以看到，作者只是比较基础地验证了LNC942能够维持METTL14的稳定性，但是对于中间的具体的机制是怎么样的，可能由于只是一条旁支的非核心机制路线，并没有作深入的探讨。结合我们之前推送的lncRNA与RBP来看，LNC942很可能也是通过结合某种RBP来调控RBP对于mRNA的稳定性的影响。

（相关阅读：让你的lncRNA摆脱miRNA的束缚（上））

我们接下来看作者怎么验证本文的核心机制，也就是LNC942影响METTL14的甲基化酶活性，作者先是通过ISH和IF验证了LNC942与METTL14的共定位（fig4g），并通过RNA pull down验证了LNC942与METTL14的结合（fig4h），这也是研究lncRNA与蛋白相互作用的基本方法。

接下来是寻找下游受m6A修饰调控的靶基因，且这些靶基因要与肿瘤以及LNC942相关。通过KEGG分析列出十种可能与LNC942表达相关的细胞功能，其中两种与肿瘤的发生有关（fig5a）。通过对这两种细胞功能相关的候选基因进行m6A位点预测，发现CXCR4和CYP1B1具有高可信度的m6A修饰位点（fig5b）。接下来，作者通过测序结果，和qPCR验证了CXCR4以及CYP1B1在乳腺癌细胞系中表达升高（fig5c，fig5d）。又通过WB和qPCR验证了沉默LNC942会降低CXCR4以及CYP1B1的表达（fig5e，fig5f）。最后，由于m6A修饰会提高mRNA的稳定性，作者通过mRNA降解实验发现沉默LNC942会加速CXCR4和CYP1B1的mRNA降解（fig1g）。

到这里，作者得到了结论，CXCR4和CYP1B1可能是LNC942介导的METTL14调控的m6A修饰的新的候选直接靶点。但是，是不是感觉少了点什么呢，感觉少了点什么就对了？这里作者缺少了对于CXCR4和CYP1B1的mRNA的m6A甲基化水平的检测。此检测使用的方法是m6A RNA免疫沉淀（m6A RIP），与一般RIP的操作相同，使用m6A的抗体得到RNA后，进行qPCR检测。

虽然这个实验还是挺关键的，但是觉得这也不影响这是一篇毕竟经典的关于lncRNA调控m6A的范文。在后续的结果里，作者也通过回复实验，验证了过表达METTL14能够逆转沉默LNC942对CXCR4, CYP1B1，m6A水平，以及肿瘤表型的影响，证实LNC942确实通过METTL14发挥作用。我们可以跟着思路图复习一遍本文的套路。