Question：实验中如何使用过表达（普拉特泽生物提供长期稳定的分子、细胞实验外包服务）

   答：一．常用基因操作方法包括：基因过表达，RNAi,CRISPR/CAS9
二．基因功能的基本研究方式

1. 对目的基因的操作：

表达上调，表达下调，使用激动剂；抑制剂；基因突变；

表达从无到有，从有到无；从低到高；从高到低等

2. 对目的基因进行操作后对功能（表型）进行检测：

生长、凋亡、氧化应激、炎症、细胞周期、血管新生、增值、迁移等等

3. 传统研究基因功能的方式

A.将基因转入到目的细胞中使得基因的表达量上调，再看细胞的功能表型

实验方法是将目的基因的CDS区也就是编码区构建到载体上，再将这个载体导入到目的细胞中，能够使得目的基因在细胞中的表达量上升

B.RNAi

RNAi：是指通过反义RNA与正链RNA形成双链RNA特异性地抑制靶基因的现象。可以通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA（有义RNA和反义RNA），从而诱导内源靶基因的mRNA降解，达到阻止基因表达的目的。（在细胞内本底表达非常低的基因不适用）

C.CRISPR-CAS9

前几期草莓分享过客关于CRISPR-CAS9的技术原理，感兴趣的可以往前几期看看

CRISPR-CAS9与RNAi的对比：

RNAi和CRISPR-Cas9在作用水平、靶位点范围、靶蛋白消除水平以及靶蛋白功能等方面存在显著差异。选择哪种技术取决于具体的研究目的和实验需求。

D.使用CRISPR-CRISPRa系统实现基因的过表达

在CRISPRa技术中，使用的是dCas9蛋白，这是一种经过改造的Cas9蛋白，其核酸酶活性被失活，因此无法切割DNA。然而，dCas9蛋白仍然能够保留其DNA结合能力，即能够特异性地识别并结合到目标DNA序列上。为了实现基因转录激活，dCas9蛋白被进一步改造，与特定转录激活因子(VP64,MS2等)相融合。当我们把gRNA的设计在某个基因的启动子上，那么这些转录因子就一股脑的到了这个启动子附近，这些转录激活因子通常具有上调启动子的活性，增加转录

CRISPRa与传统基因过表达方法的对比

CRISPRa的优点：

高特异性：CRISPRa利用dCas9与sgRNA的特异性结合，能够精确地激活目标基因

调控细致：该技术能够在基因的自然位点上调控表达，避免了传统过表达方法中可能出现的非生理水平的表达，使得调控更为细致和准确。

不改变基因组背景：CRISPRa技术不直接改变内源基因组序列，仅通过转录激活来上调基因表达，减少了潜在的安全风险。

多基因调控能力：通过设计多条sgRNA，CRISPRa可以同时激活多个靶基因，为复杂基因网络的研究提供了有力工具。

CRISPRa的缺点：

激活效率不完全：尽管CRISPRa具有较高的特异性，但激活效率可能不完全，有时无法达到预期的基因表达水平。

脱靶效应风险：虽然CRISPRa的特异性较高，但仍存在脱靶效应的风险，即可能错误地激活非目标基因的表达。

传统基因过表达方法的优点：

实验操作简单：传统基因过表达方法的实验步骤相对简单，通常只需构建包含目标基因的质粒并导入细胞即可。

激活效率高：由于直接导入外源基因，传统过表达方法通常具有较高的激活效率，能够迅速提高目标基因的表达水平。

传统基因过表达方法的缺点：

调控不细致：传统过表达方法往往难以模拟生理条件下的基因表达模式，调控细致度较低。

扩增CDS可能受限于序列

可能产生免疫反应
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