RNA pull-down实验步骤由普拉特泽生物为大家总结分享，RNA pull-down作为研究RNA与蛋白互作的核心技术，已成为研究焦点。普拉特泽生物分子检测中心承接RNA pull-down实验代做上百例，总结了一套自己的高效常用的RNA pull-down实验步骤，分享给初次接触本实验的实操小白们，希望能帮到你哦！

  RNA pull-down其目的是检测与RNA互作的蛋白。实验过程简单来说就是把感兴趣的RNA进行体外转录，并标记（如生物素标记），再与细胞裂解液共同孵育，形成RNA-蛋白质复合物，然后将分离得到蛋白质，通过WB 或质谱进行验证或鉴定。

        1、磁珠准备

        （1）取3 µg Biotin标记的RNA，加入适量Structure Buffer，使得RNA形成二级结构。然后将RNA 95℃加热2 min，冰浴3 min，室温静置30 min；

        （2）磁珠准备：使用RIP Lysis 500 µL冲洗磁珠3次，用50 µLRIP Lysis Buffer重悬磁珠；

        （3）将磁珠加入到第（1）步的RNA中，室温孵育1h；

        （4）将磁珠与RNA的混合物去上清；

        （5）RIP Lysis Buffer冲洗3次，切记将液体沿壁加入或滴加，上下缓慢翻转混匀。

        2、 RNA Pull down（提取总蛋白做）

        （1）用500 uL RIP Lysis Buffer（使用时加入RNase抑制剂与蛋白酶抑制剂）裂解细胞，并用细胞破碎器破碎细胞，冰上裂解15 min，4℃ 12000 rpm离心20 min，弃沉淀，保留上清；

        （2）往2.1制备的磁珠-RNA混合物中加入上述上清液，室温孵育2 h；

        （3）将孵育好的磁珠-RNA-蛋白混合物弃上清，使用RIP Lysis Buffer冲洗5次，1次1 mL；

        （4）向磁珠中加入生物素洗脱液，室温、混匀仪上洗脱15 min；

        （5）放入磁性分离器中，将液体转移到新的EP管中，该液体即为洗脱产物；

        （6）取部分洗脱产物于混合物中加2×SDS上样缓冲液，95℃变性10 min，跑SDS-PAGE凝胶；剩下的产物可用于质谱。

        3、SDS-PAGE与染色

        配制好胶，将准备好样品上样，恒流，16mA/胶，直至溴酚蓝跑至胶底部，完成电泳。电泳结束后，用硝酸银染色

        （1）固定：30 min（乙醇：乙酸：水=4：1：5体积比）；

        （2）敏化：30 min（乙酸钠10.2 g，硫代硫酸钠0.471 g，乙醇45 mL，加水至150 mL）；

        （3）水洗4次，每次10 min；

        （4）银染：30 min（硝酸银0.375 g，加水至15 mL）；

        （5）水洗2次每次40s；

        （6）显色：显影至条带清楚（碳酸钠4.5g，72 uL甲醛，加水至180 mL）；

        （7）终止：5 min（Na2EDTA   2.19g，加水至150 mL ） 。

        好啦，那关于RNA pull-down实验的操作步骤咱们就讲完啦，没有看懂的话可以随时给我们留言，技术会详细给到解答的哦；。如果您有RNA pull-down实验外包与代做的需求，欢迎选择普拉特泽~