RIP（RNA Immunoprecipitation）实验是一种基于抗体的技术，用于研究体内RNA与蛋白质之间的相互作用。该实验通过捕获特定RNA结合蛋白（RBP）及其结合的RNA，然后鉴定这些RNA的种类，从而揭示RNA-蛋白质相互作用的细节下面，普拉特泽生物为广大科研人员提供长期稳定的番红固绿染色外包实验服务，普拉特特生物将详细阐述RIP实验的基本步骤流程，以期为科研小白们提供一个清晰、系统的操作指南。

一、细胞裂解

①准备细胞：将细胞培养至状态良好，吸除培养基。

②清洗细胞：用10 mL冰冷的PBS洗涤培养瓶或平板上的细胞两次，以去除培养基和其他杂质。

③收集细胞：加入10 mL冰冷的PBS，用细胞刮从培养瓶或平板上刮下细胞，并转移到离心管中。

④离心收集：在4℃下以1500 rpm离心5分钟，收集细胞并丢弃上清液。

⑤裂解细胞：用与细胞等体积的RIP裂解缓冲液重新悬浮细胞颗粒，通过上下移液混合直至细胞被分散，混合物呈现均匀。将裂解液放在冰上孵育5分钟，使低渗RIP缓冲液膨胀细胞。

⑥分装保存：将每个裂解液的约200 μL分配到无核酸酶的微离心管中，并在-80℃下保存。

二、磁珠准备

Ⅰ.实验前准备：确保所有实验用品（如enpendoff管、磁力架、枪头、RIP Wash Buffer等）已准备好并置于冰上。

Ⅱ重悬磁珠：将磁珠重悬并标记实验所需的enpendoff管，包括目的样品、阴性对照与阳性对照。

Ⅲ清洗磁珠：每管加入50 μl重悬后的磁珠悬液和500 μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡后置于磁力架上，左右转动15°使磁珠吸附成一条直线，去上清，重复一次。

Ⅳ抗体孵育：用100 μl的RIP Wash Buffer重悬磁珠，加入约5 μg相应抗体于每个样品中，室温孵育30分钟。

Ⅴ再次清洗：孵育后，将enpendoff管置于磁力架上，弃上清，加入500 μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡后弃上清，重复一次，然后置于冰上。

三、RNA结合蛋白免疫沉淀

→准备缓冲液：制备RIP Immunoprecipitation Buffer。

→混合裂解液与磁珠：将上一步的enpendoff管放磁力架上，去上清，每管加入900 μl RIP Immunoprecipitation Buffer。迅速解冻细胞裂解液，在4℃下以14000 rpm离心10分钟，吸取100 μl上清液于磁珠-抗体复合物中，使总体积为1 ml。

→孵育：在4℃下旋转孵育3小时至过夜。

→清洗：孵育完后，短暂离心，将enpendoff管放在磁力架上，弃上清，加入500 μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡后弃上清，重复清洗6次。

四、RNA纯化

▲准备Proteinase K Buffer：每个样品需150 μl Proteinase K Buffer。

▲消化蛋白质：用150 μl Proteinase K Buffer重悬磁珠-抗体复合物，55℃孵育30分钟。孵育完后，将enpendoff管置于磁力架上，将上清液吸入一新的enpendoff管中。

▲提取RNA：于每管上清液中加入250 μl RIP Wash Buffer，再加入400 μl苯酚:氯仿:异戊醇（125:24:1），涡旋震荡15秒，室温下以14000 rpm离心10分钟。小心吸取上层水相，重复氯仿抽提一次，最后加入无水乙醇沉淀RNA。

▲清洗与溶解：用80%乙醇清洗沉淀，晾干后重新悬浮在10到20 μL的无RNase的水中，并置于-80℃保存。

五、QPCR检测

▲配制反应体系：根据qPCR实验要求配制反应体系。

▲RT反应：将RNA样品进行逆转录反应，生成cDNA。

▲qPCR检测：将cDNA样品进行qPCR检测，分析目标RNA的表达情况。

六、实验后篇章：数据分析，洞见未来

1. RNA质量检测与测序 对提取的RNA进行质量评估，确保无降解且纯度达标。随后，可采用高通量测序技术（如RNA-seq）对RNA进行深度分析，揭示其序列信息及可能的互作对象。

2. 数据解读与生物信息学分析 借助生物信息学工具，对测序数据进行比对、注释和差异分析，识别出与特定RNA显著互作的蛋白质或RNA分子。结合已有文献和数据库资源，构建RNA互作网络模型。

3. 验证与拓展 通过体外实验（如EMSA、Pull-down）或体内实验（如CRISPRi/a）验证RIP实验的结果，并进一步探究互作机制及其在生物体内的功能意义。

七、结语

RIP实验，作为研究RNA互作网络的金钥匙，正引领着生命科学领域的新一轮探索热潮。从精心准备到精准操作，再到深入的数据分析与验证，每一步都凝聚着科研工作者的智慧与汗水。让我们携手并进，在RNA互作的广阔天地中，不断发现新知，推动生命科学向前发展！

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好，RIP实验步骤就介绍到这里啦~

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