今天普拉特泽生物跟大家一起学习的是RIP实验材料的准备，前面的文章我们讲解了RIP（RNA Immunoprecipitation）实验是一种基于抗体的技术，用于定位并鉴定体内的RNA-蛋白质相互作用。该技术通过捕获特定的RNA结合蛋白（RBP）及其结合的RNA，进而分析这些RNA的序列和功能。而普拉特泽生物——分子检测平台也非常重视这一点，为广大科研人员提RIP实验服务的同时，还详细介绍RIP实验所需的主要材料准备步骤，确保大家实验能够顺利进行并获取可靠的结果。

——实验材料

①主要试剂

㈠RIP试剂盒：推荐使用Millipore的RIP试剂盒（cat. No 17-701），该试剂盒包含了一系列用于RIP实验的必需试剂。

㈡PMSF：蛋白酶抑制剂，用于防止蛋白质降解，来源Genstar（cat. No B111-01）。

㈢磷酸酶抑制剂：Selleck（cat. No B15001），用于防止磷酸酶对实验样本的干扰。

㈣蛋白酶抑制剂：Selleck（cat. No B14001），同样用于防止蛋白质降解。

㈤反转录试剂盒：TAKARA RR037A，用于将RNA反转录为cDNA，以便进行后续PCR分析。

㈥qPCR试剂盒：yeasen 11202ES03，用于实时荧光定量PCR，以检测特定RNA的表达水平。

——主要仪器及器材

㈠高速离心机：enppendorf 5810R，用于细胞裂解和样本处理。

㈡荧光定量qPCR仪：Thermo Fisher Scientific ViiA7，用于qPCR实验的数据采集和分析。

㈢磁力架：用于磁珠的分离和洗涤。

㈣涡旋震荡器：用于试剂的混合和样本的均质化。

㈤移液器及枪头：用于精确量取和转移实验样本和试剂。

——样本准备

①细胞样本

Ⅰ细胞培养与收集：选择适当的细胞系进行培养，如HTR-8细胞。当细胞达到所需密度时，用冷PBS清洗两次，然后用细胞刮将细胞刮下，收集至离心管中。

Ⅱ细胞裂解：每1x10^7个细胞加入500µl的RIPA裂解液，并加入PMSF、磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，再加入10% SDS和Triton X-100，翻转裂解过夜后，于-20℃保存。

②组织样本

Ⅰ组织取材与清洗：取下新鲜组织，迅速用预冷的0.9%生理盐水漂洗，以去除残留血液和杂质。

Ⅱ组织处理：将组织剪切成小块，用匀浆器或其他细胞分离设备分散为单个细胞，然后进行离心和裂解处理，步骤与细胞样本类似。

③磁珠准备

Ⅰ重悬磁珠：根据实验需求，取适量磁珠进行重悬。
Ⅱ清洗磁珠：将重悬后的磁珠加入RIP Wash Buffer，涡旋震荡后置于磁力架上，去除上清液，重复清洗数次。

Ⅲ抗体孵育：用RIP Wash Buffer重悬磁珠后，加入约5µg的相应抗体，室温孵育30分钟。

ⅣRNA结合蛋白免疫沉淀

Ⅴ配置RIP Immunoprecipitation Buffer：按照实验要求配置所需缓冲液。

Ⅵ孵育：将磁珠-抗体复合物与细胞裂解液混合，4℃孵育3小时至过夜。

Ⅶ清洗：孵育完成后，用RIP Wash Buffer清洗磁珠-抗体复合物，去除非特异性结合的RNA和蛋白质，重复清洗数次。

④RNA纯化

Ⅰ蛋白酶K处理：用Proteinase K Buffer重悬磁珠-抗体复合物，55℃孵育30分钟，以消化结合的蛋白质。

ⅡRNA提取：将上清液转移至新管中，加入RIP Wash Buffer后，进行RNA提取，包括苯酚-氯仿抽提、乙醇沉淀等步骤。

ⅢRNA溶解：用DEPC处理水溶解提取的RNA，并进行后续分析。

——结论

RIP实验的材料准备是实验成功的关键步骤之一。通过合理选择试剂、仪器和样本，并严格按照实验步骤进行操作，可以确保实验结果的准确性和可靠性。此外，样本的采集、处理和保存也是影响实验结果的重要因素，需要特别注意。希望本文能为RIP实验的材料准备提供有益的参考。

好，今天关于RNA免疫沉淀

实验材料的准备及结论

就说到这里

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